鳗弧菌rtx基因簇地克隆及相关基因功能地初步研究

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1、http://www.paper.edu.cn鳗弧菌RTX基因簇的克隆及相关基因功能的初步研究周凌云，刘琴，王启要，张元兴华东理工大学生物反应器工程国家重点实验室，上海（200237）E-mail:yxzhang@ecust.edu.cn摘要：以鳗弧菌（Vibrioanguillarum）野生株MVM425基因组DNA为模板，根据已报道的弧菌属I型分泌系统相关基因的保守序列设计引物，通过PCR及genomewalking等方法，克隆得到长约9kb的鳗弧菌I型分泌系统RTX基因簇，包括三个完整分泌元件基因rtxB，rtxC，rtxD，及部分被分泌蛋白编码基因r

2、txA。为了考察上述系统的分泌功能，利用插入失活技术分别构建得到rtxB，rtxC的突变株VABM和VACM，选取鳗弧菌的两类重要分泌型物质（胞外多糖和胞外蛋白酶）为研究对象，检测结果表明：与野生株相比，突变株的胞外多糖活性无明显变化，胞外总蛋白酶活性分别降低71%（VABM）和58%（VACM）。因此，鳗弧菌I型分泌系统可能参与了部分蛋白酶的分泌，而没有参与多糖类物质的胞外运输过程。关键词：鳗弧菌，分泌系统，RTX基因簇，突变株中图分类号：Q71．引言鳗弧菌（Vibrioanguillarum）是世界范围内海水和淡水鱼类弧菌性流行病的主要病原体之一，可导致

3、一种对鲑鱼、鳗鱼等许多鱼类高度致死的出血性败血病。V.anguillarum的主要特征为：兼性厌氧，弧形状，极生单鞭毛，革兰氏阴性，最适生长温度25~28℃，0%NaCl和高于6~7%NaCl不生长。有多种血清型：O1型、O2型和O3型等。其中O1型鳗弧菌是危[1]害养殖鱼类最主要的鳗弧菌种群。革兰氏阴性菌主要有五种典型的蛋白分泌机制，其中I型分泌系统组成最为简单，经由I型系统分泌的主要是RTX（RepeatsinToxin）类蛋白，如大肠杆菌的溶血素（hemolysin）或B.pertussis的腺苷酸环化酶、蛋白酶、脂肪酶等胞外酶等，以及一些细胞表面依附

4、蛋白如S层蛋白、多糖、聚糖等。整个分泌过程仅涉及3个元件蛋白：一个ABC（ATP-bindingcassette）蛋白，一个内膜融合蛋白（Membranefusionprotein,MFP），及一个TolC家族的外膜蛋白。这些分泌元件往往和被分泌蛋白编码于同一基因簇内。I型系统的信号肽是位于C末端的[2-4]40-60个氨基酸，且在分泌后不被切除。对海洋弧菌属分泌系统的研究主要集中在霍乱弧1http://www.paper.edu.cn菌（Vibriocholerae）、创伤弧菌（Vibriovulnificus）和副溶血弧菌（Vibrioparahaemo

5、lyticus）[5,6][7]。1999年，Fullner等人报道了霍乱弧菌E1Tor的染色体上含有一个RTX毒素基因簇，并[8]于2004年完成了对各功能基因的鉴定，给出了霍乱弧菌I型分泌途径的分泌过程模型。RTX基因簇包含一个起活化作用的酰基转移酶基因rtxC，以及毒素蛋白结构基因rtxA。其反向操纵元则编码一套I型分泌系统元件蛋白，分别是ATPase基因rtxB，膜融合蛋白rtxD。基于弧菌属I型分泌系统的保守性，本文通过PCR等方法，克隆得到长约9kb的鳗弧菌I型分泌系统RTX基因簇rtxACBD。并利用插入失活技术分别构建rtxB，rtxC基因的

6、突变株，以考察该分泌系统中各元件蛋白的功能。检测表明突变株的胞外多糖活性无明显变化，胞外蛋白酶活性比野生株降低约71%及58%。因此，鳗弧菌I型分泌系统可能参与了部分蛋白酶的分泌，而没有参与多糖类物质的胞外运输过程。2．材料与方法2.1试剂、菌株、质粒和培养基DNA限制性内切酶，高保真pyrobest聚合酶，T4DNA连接酶，pMD19-T载体，LAPCRinvitrocloningkit购自Takara公司；标准核酸相对分子质量（λDNAHindIII、MarkerIII），细菌基因组抽提试剂盒，质粒抽提试剂盒，凝胶回收试剂盒购自Tiangen公司。大肠杆

7、菌Top10，cc118λpir及SM10λpir，质粒pNQ705-1为本实验室保存，鳗弧菌野生株[9]MVM425（O1血清型）为本实验室分离并鉴定得到。LB培养基（每升含10g胰蛋白胨，5g酵母提取物，5gNaCl（低盐）/30gNaCl（高盐），固体培养基每升加入15g琼脂粉），培养基中氨苄青霉素、氯霉素的添加浓度分别为100µg/ml和30µg/ml。大肠杆菌于37°C下培养于低盐LB培养基，鳗弧菌于30°C下培养于高盐LB培养基。2.2实验方法2.2.1鳗弧菌I型分泌系统的克隆根据已报道的霍乱弧菌及创伤弧菌的RTX基因簇保守序列设计引物P1，P2

8、，以鳗弧菌野生株MVM425基因组DNA为模板进行P