鳗弧菌金属蛋白酶单克隆抗体的制备及鉴定.pdf

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1、高技术通讯2003.2鳗弧菌金属蛋白酶单克隆抗体的制备及鉴定d陈师勇i张培军＠莫照兰张振冬邹玉霞徐永立（中国科学院海洋研究所海洋生物学重点实验室青岛266071）摘要鳗弧菌M3胞外产物经纯化得到分子量为36.5kDa的金属蛋白酶，浓缩后作为抗原免疫BALB／C小鼠。经细胞融合及筛选，得到三株稳定分泌抗金属蛋白酶的杂交瘤细胞株，分别命名为P2B1、P4A3和P4B1。亚型鉴定结果表明，三株细胞株产生的单抗均为IgG3型。蛋白质印迹（WesternBlot）分析显示，所得到的单抗只与分子量为36.5kDa的金属蛋白酶反应，具有

2、较高特异性。三株单抗均能有效抑制蛋白酶活性。关键词鳗弧菌，金属蛋白酶，单克隆抗体析和HPLC凝胶色谱层析纯化，最后得到电泳纯的0引言蛋白。经超滤杯浓缩至3mg／ml后作免疫动物抗原用。鳗弧菌（Vibrioanguillarum）是引起水产养殖1.2实验动物和细胞系流行性疾病的一种重要病原，曾经在世界范围内引BALB／C纯系小鼠，雌性，6～8周龄，购自中山起养殖鱼类的流行病爆发［1，2］。在山东荣城寻山养医科大学实验动物中心。鼠骨髓瘤细胞SP2／0，中鱼场，我们从濒临死亡的患病牙鲆中分离出一株鳗山医科大学免疫学教研室惠赠。弧

3、菌强毒性株M3［3］。实验过程发现鳗弧菌M3的1.3动物免疫和细胞融合［4］首次免疫用抗原与弗氏完全佐剂按1：1的比例胞外产物（ECP）具有强致病性，并进一步从ECP［5］混合乳化，腹腔注射BALB／C小鼠，每只鼠每次注中分离纯化到一个毒性极强的金属蛋白酶，其对射0.2ml，共注射4次。第二、第三次间隔两周，用金鱼的半数致死量（LD）为1.2蛋白／g体重。50＠g弗氏不完全佐剂乳化的等量抗原加强免疫，第四次为了解此蛋白酶在鳗弧菌致病过程中所起的作用，等量抗原不加佐剂直接注射进行冲击加强免疫。需要有特异性的抗体作为工具进行研

4、究。在本文细胞融合、克隆参考朱立平方法［6］。中，我们以纯化的蛋白酶为抗原，制备其单克隆抗1.4蛋白酶单抗的筛选———间接ELISA法体，并对单抗的性质进行了鉴定。用纯化的0.1ml蛋白酶（0.15mg／ml）包被酶标板，检测时细胞培养上清为一抗，辣根过氧化物酶标1材料和方法记的羊抗鼠IgG为二抗，邻苯二胺-过氧化氢底物溶液显色后测OD值。4921.1抗原的制备1.5SDS-PAGE及蛋白质印迹免疫动物和筛选抗体用的鳗弧蛋白酶SDS-PAGE电泳、染色和蛋白质印迹分菌金属蛋白酶抗原均为本实验室纯［7］析（Western-B

5、lot）方法参照《分子克隆实验指南》。化制备。鳗弧菌致病株的ECP经浓缩胶为5%，分离胶为12%。蛋白质印迹分析时，超滤杯（PALL公司，截留分子量1先经SDS-PAGE电泳，将凝胶上标准蛋白泳区切万）浓缩后，经SephadexG100凝胶下，用考马斯亮兰染色，余下部分凝胶用Biorad公层析、DEAE-cellulose离子交换层司的蛋白转印装置将分离的蛋白质带转印至硝酸纤d973规划（G1999012003）资助项目。i男，1976年生，博士生；研究方向：海洋生物技术，水产动物病害学。＠联系人。（收稿日期：2002-0

6、8-01）—102—陈师勇：鳗弧菌金属蛋白酶单克隆抗体的制备及鉴定维素薄膜上（100V转印4h）。以单克隆抗体细胞培2.2金属蛋白酶单抗细胞株的建立养上清作为一抗，过氧化物酶标记羊抗鼠IgG作为BALB／C小鼠经4次免疫后，取脾细胞与SP2／二抗，加DAB（3，3*-二氨基联苯胺盐酸盐）底物溶液0细胞融合，分配在5块24孔板中培养。10天后所显色。有的细胞培养孔都长出细胞克隆，经ELISA分析，1.6蛋白酶活性抑制实验：从中筛选到6个分泌蛋白酶抗体的阳性孔。阳性孔蛋白酶活性抑制实验参照Noriko方法［8］。将内的细胞经过

7、3次有限稀释克隆化，得到3株生长0.025ml酶样品、10mmol／Lp~8.0Tris-~Cl缓冲液良好并稳定分泌抗体的单克隆细胞株，分别命名为0.05ml与0.025ml单抗混匀，在室温下孵育10minP2B1、P4A3和P4B1，其细胞培养上清抗体的后，加入5mg／ml蛋白酶底物azocasein（Sigma）ELISA效价分别为1：2，1：10和1：20。0.1ml，28C反应0.5h后，加0.7ml三氯乙酸终止反2.3蛋白质印迹图谱应。离心取上清，加入等体积0.5mol／LNaO~，在鳗弧菌ECP经SDS-PAG

8、E电泳分离，转印至硝440nm波长下测光吸收值。对照实验为只有酶样酸纤维素薄膜后，与各个单抗细胞培养上清进行免品和Tris-~Cl缓冲液共孵育。以对照组酶活力为疫印迹反应。结果是，所制备的蛋白酶单抗P2B1、100%，测相对酶活力。P4A3和P4B1均仅与ECP中分子量为36.5kDa的1.7单克隆抗体