灰葡萄孢t-dna插入突变体库的构建及其致病相关基因研究

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1、华中农业大学硕士学位论文灰葡萄孢T--DNA插入突变体库的构建及其致病相关基因研究姓名：范雷申请学位级别：硕士专业：植物病理学指导教师：李国庆201206灰葡萄孢T-DNA插入突变体库的构建及其致病相关基凶研究摘要灰葡萄孢(Botrytiscinerea)引起植物灰霉病，寄主达200多种植物，包括多种蔬菜、水果和观赏植物，造成重大的经济损失。为了探究持久控制灰霉病的新策略，有必要从分子水平上探究灰葡萄孢的致病机理。本研究以灰葡萄孢(肋缈t／scinerea)菌株RoseBC．3为材料，采用根癌农杆菌介导转化技术获得了1000多个T-DNA随机插入突变体。对其中部分突变

2、体的生物学性状以及T-DNA插入位点侧翼序列进行了分析。取得了以下成果：(1)优化了根癌农杆菌介导的灰葡萄孢菌株RoseBC．3的遗传转化体系。确定了筛选转化子的最适潮霉素浓度为50lxg／ml，共培养的最适温度为22。C，最适分生孢子浓度为1x105个孢子／ml，最高转化效率达到100个转化子／ml(直径为9cm)。(2)获得了含1000多个转化子的T-DNA插入突变体库。对部分转化子进行了继代培养、PCR鉴定和Southern杂交鉴定，证明所获得转化子为T-DNA插入突变体，它们对潮霉素的抗性特征具有遗传稳定性。对随机选取的8个突变体进行Southern杂交鉴定，

3、发现7个突变体为单拷贝插入，占87．5％，1个突变体为双拷贝，占12．5％。通过对突变体生物学性状进行分析，将其分为6类，即产孢显著减少或不产孢突变体、生长速率减慢突变体、菌丝稀疏突变体、菌落颜色异常突变体、致病力丧失突变体和致病力增强突变体。(3)通过反向PCR技术和hi．tailPCR技术扩增获得了部分突变体中T-DNA插入位点的侧翼序列。扩增得到16个有效DNA序列，对其进行分析发现，14个T-DNA侧翼序列为灰葡萄孢序列，2个序列为载体序列。还发现T-DNA在编码区插入和在非编码区插入的突变体数目是相同的，说明T-DNA的插入是随机的。(4)对突变体ATl5、

4、AT239、AT426与RoseBC．3的菌落形态、生长速率、产孢量、孢予萌发率、淀粉酶活性、产酸能力、侵染结构等方面进行了比较研究。发现这些突变体均具有淀粉酶活性，均能产酸。AT426是致病力减弱突变体，其生长速度减慢(尸

5、士研究生学位论文生长速率与RoseBC．3没有显著差异(尸>O．05)，侵染垫的形成时间比RoseBC．3早，数量也显著多于RoseBC一3伊<0．05)，其中T．DNA插入在假定蛋白BClG00493基因前17bp处。这3个突变体中T-DNA插入破坏的基因可能与灰葡萄孢致病性相关。本研究所优化的灰葡萄孢T-DNA遗传转化体系及所获得的致病相关基因为研究灰葡萄孢致病分子机制奠定了基础，同时提供了一些有用的研究材料。关键词：灰葡萄孢；根癌农杆菌介导的遗传转化；T-DNA插入突变体；hi—tailPCR；inversePCR；序列分析IV灰葡萄孢ToDNA插入突变体库的构

6、建及其致病相关基因研究AbstractBotrytiscinereaisthecausalagentforplantgreymoulddisease．Itcallinfectmorethan200crophostsworldwideandcauseseriouseconomiclosses．Inordertodesignnovelstrategiesforcontrolofgreymoulddisease，itisquitenecessarytobetterunderstandmolecularmechanismsduringpathogenesisofB．ciner

7、ea．Inthisthesis，morethan1000transformantsofB．cinereastrainRoseBC一3havebeenobtainedbyAgrobac陀riumtumefaciens-mediatedtransformation(ATMT)，severalcharactersandtheT-DNAflankingsequencesofsometransformantshavebeenanalyzed．Followingresultshavebeenachieved：(1)TransformantsofB．cinerea