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1、《国外》(,1988医药抗生素分册....’’..’犷八~~八~八八~交{综述与译文{。。...。权~~~~~0~。汤链霉菌的基因克隆化a.Iin5Hunter。异源性宿主小小链霉菌中转化了的小小链一引言。霉菌宿主会产生放线紫红素这种实验表明·链霉菌属的基因克隆是比较新的技术。了通过种间DNA克隆化产生抗生素的现实。自1980年第一篇链霉菌基因克隆的报道发表性至。今还不到四年的时间现在的基因克隆技、二链霉菌ONA克隆的策略术使我们能够在链霉菌中做以前所不能做的。o(一)宿主菌实验链霉菌分子生物学的基础是由H-P株。,。d根据该实验室二十五年来所得到的大进行克隆实验
2、时首先是选择链霉菌的。。量的遗传信息建立起来的宿主忽略这一点往往造成克隆实验的失。。,链霉菌是革蓝氏阳性菌它含有一个单败因此应根据下述标准选择适宜的宿,4。。环的染色体其基因组的大小为10kb天蓝主。色链霉菌A3(2)是最有代表性的例子近年1.宿主表型,D来链霉菌属中的许多分子生物学研究仅仅筛选链霉菌NA基因库是取决于被克。,注意到分子技术的发展现在这些技术已用隆的基因表型表达作用即受体必须缺乏一。,来进行抗生素生产和其它令人感兴趣的链霉种酶活力当基因克隆到载体时可由该基。。菌生物学方面的研究已知天然抗生素中约因的产物来补充这种酶活性例如克隆一种。,有60%以上是
3、由链霉菌产生的因而各制药耐药基因就要求宿主必须对那种药物敏,;公司在筛选新的天然产生菌的来源过程中感克隆一种与氨基酸生物合成有关的基。,把它作为一类主要的寻找菌类由于寻找新因就要求宿主是该种氨基酸的营养缺陷,,。结构研究工作的不断进行重组DNA技术不型因为它缺少那种基因的产物我们提倡,选择对,ó.下.,-但可用于筛选策略上还可用于提高产生新药物敏感的受体因为它不会发生回。。,抗生素菌株的发酵单位通过克隆抗生素产复突变当需要一种营养缺陷型的宿主时,生基因由一个菌种的基因转入另一产生菌应选用突变菌株但它回复为原养型的频率,。。,中这样可使重组技术用来产生新的抗生素必须
4、要低被选择作为宿主菌株时应当试,“”在生物技术年代抗生素的商品化使我们验它们对通常所用的链霉菌载体的药物标。,,、、的注意力集中到这一方面至今有关抗生素记如硫链丝菌素新霉素紫霉素和红霉,。生产方面的基因表达相对来说知道得很少素的敏感度但已有报道有关这些生物合成途径的基因克2.宿主转化效率Z再生效率。隆天蓝色链霉菌产生的放线紫红素的全部文中二(三)论述了基因库的统计分析方。,生物合成途径已经克隆到它的阻断突变株法如用未切割的载体链霉菌原生质体的。105“中克隆的基因已转入一种不产生抗生素的转化数小于/g(即在连接反应中的载体拼,;约为叮就不能接受大量的DNA来组(1
5、)挑选另一种没有问题的宿主。,;建基因库(2)诱变宿主降低其限制性活力(1)转化效率明显低的原因可能不是由,(3)为减弱限制性内切酶活性对原生,。于它们自身转化力低而是由于已经转化的“”质体进行热处理。,.原生质体的再生能力差此时为了增强它:第三种方法是原生质体在45~50℃下,,,们的再生能力应试行一下三(六)中所提出培养10~巧分钟使其限制性内切酶变性但。。的,再生方法原生质体存活且能进行转化各菌株所需,。(2)如果是本身转化力低就需要改换,的确切温度和时间依经验而定但是并非,SCP载体例如当龟裂链霉菌用来切割的Z所有的菌株都具有不耐热性的限制性内切酶,“,。
6、系列载体进行转化时转化率<10叮g可活性pIJ101复制子进,是以行转化时转化率>4二宿主的DNA晦活性。10“加g一些链霉菌具有使DNA降解的强活性(3)如果(1)和(2)都不能导致转化率接,它,胞外酶由原生质体往外渗漏或是存在5,。近10加g就要选用另一种宿主。,于某些原生质体溶解后的溶液中因此如.3宿主的限制性内切酶活性DNA加到原生质,果质粒体中时将有部分,。许多链霉菌有很强的限制性内切酶系D耳A降解而使得转化作用不活跃习。统具有强的限制性内切酶活性使其免受噬;丢石检测DNA酶活性是将一定量的质粒加。,菌体的感染用于工业生产的菌株能在大发到原生质体中作短时
7、间培养然后离心除去。,。,酵罐中得到旺盛生长在克隆实验中当它原生质体上清液行琼脂糖凝胶电泳检测,。,们用作受体菌株时能限制来自供体的插入其DNA的降解情况如果有ONA酶活性,“”。,“”。DNA即外源DNA因此就不能得到就要试验热处理是否能使DNA酶失活在。DNA之前先在原生质体中加入异一个完好的基因库加入质粒试验供体和受体源DNA例如小牛胸腺D又A,以减少DNA间是否有存在限制性屏。,酶的降解10微克的小牛胸腺障的最好方法是将质粒转化到供体中再从DNA加到,10转化体中分离出质粒DNA用它去转化受0微克的原生质体中对质粒DNA的转化并体`如果没有限制性屏障存在的
8、话,’质粒
