金色链霉菌工业生产菌株基因转移系统的研究

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1、河北医科大学硕士学位论文金色链霉菌工业生产菌株基因转移系统的研究姓名：丰玫玫申请学位级别：硕士专业：药剂学指导教师：贺建功20080301河北医科大学学位论文使用授权及知识产权归属承诺本学位论文在导师(或指导小组)的指导下，由本人独立完成。本学位论文研究所获的研究成果，其知识产权归河北医科大学所有。河北医科大学有权对本学位论文进行交流、公开和使用。凡发表与学位论文主要内容相关的论文，第一署名单位为河北医科大学，试验材料、原始数据、申报的专利等知识产权均归河北医科大学所有。否则，承担相应的法律责任。研究生签

2、名：幸张伙导师签名刁f◇劳院领导签名：呻年5只《El研究生学位论文独创性声明本论文是在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果，除了文中特别加以标注和致谢等内容外，文中不包含其他人已经发表或撰写的研究成果，指导教师对此进行了审定。本论文由本人独立撰写，文责自负。研究生签名：专毂攻导师签名：亨重功郴年岁月形Et中文摘要金色链霉菌工业生产菌株基因转移系统的研究摘要目的：四环类抗生素最早发现于20世纪40年代末，是一种很好的快速抑菌剂。其作用机理主要是和细菌30S核糖体的末端结合，从而阻止肽链延伸和细菌蛋白质合

3、成。由于其具有广谱、使用方便、经济等特点，已被开发为兽用抗生素和饲料添加剂，目前在畜牧业上得到了广泛的应用。金色链霉菌(Streptomycesaureofaciens)是四环素工业生产用菌，为了迸一步提高产量、降低生产成本，其菌种改良成为链霉菌工业的重要攻关课题之一。多年以来，基于理化诱变和分离筛选的传统育种方法在链霉菌生产菌种的改良方面取得了显著的成绩，但随着产量水平的提高，传统方法的局限性越发明显。随着现代分子生物学的发展，我们已能在基因水平对菌种进行改造，通过导入外源基因，有目的地改造菌种的代谢途

4、径，实现菌种选育的理性化，甚至产生新的化合物。在基因水平对一个链霉菌进行改造的首要的问题就是建立所研究菌株的基因转移系统。目前，有关金色链霉菌转基因系统的研究国内外鲜有报道，而高产工业生产菌株，由于已经过了多轮诱变处理，与野生菌种又有很大不同。本研究探索建立了四环素工业生产菌株的基因转移系统，为进一步利用基因工程技术对其进行菌种改良奠定基础。方法：l金色链霉菌工业生产菌株原生质体的制备和再生；2金色链霉菌工业生产菌株耐药性调查，确定筛选标记；中文摘要3PEG-介导的质粒D1姨转化金色链霉菌原生质体；4接合

5、转移系统的建立；5电转化：6阳性克隆的PCR鉴定分析。结果：通过试验确定了金色链霉菌工业生产菌株4．6的原生质体制备和再生条件：菌丝体培养选择加2％甘氨酸的S培养基，采用一级培养法，30。C培养20h，收获菌丝体；制备原生质体时，溶菌酶的浓度为2％，酶解温度控制在35*(2，酶解时间为1．5～2．Oh；原生质体再生选用原固体培养基加0．2mol／L的蔗糖，平皿要保持干燥，35℃再生培养，再生率最高为16．97％。尝试用整合型质粒pZMW和穿梭型质粒pZM分别转化金色链霉菌4．6原生质体，均未成功。考察了菌

6、丝培养时间、原生质体和质粒的浓度、PEG分子量和浓度、缓冲液、抗性选择时间等因素对转化的影响，也对定位于细胞膜的DNase进行了灭活处理，也都没有转化成功。说明金色链霉菌工业生产菌株对外源DNA有很强的限制作用。接合转移和电转化可以克服某些链霉菌的限制修饰系统。但电转化在我们的实验条件下也是不成功的。利用大肠杆菌ETl2567(puzs002)和双功能质粒载体pZMW后，探索了通过接合转移的方法从大肠杆菌向金色链霉菌转移质粒的可能性。经接合转移操作后的平皿用l面含有萘啶酸(作用浓度均为50ug／rnl)和

7、氨普霉素(作用浓度为30ug／m1)的水溶液覆盖，再生的菌落经PCR鉴定分析，即为阳性克隆。结论：金色链霉菌工业生产菌株对外源DNA有很强的中文摘要限制作用。常规的PEG．介导的原生质体转化法不能将外源DNA导入该菌体中，尽管电转化法可以克服链霉菌的某些限制修饰系统，但在我们的实验条件下，也不能获得转化子。本实验建立了金色链霉菌工业生产菌株经济、快捷的基因转移系统——接合转移系统。用含有ortT的大肠杆菌——链霉菌双功能质粒载体转化含有RP4因子的大肠杆菌ETl2567(pUZ8002)的感受态细胞，得到

8、含有质粒的供体菌株，再用这些携带有质粒和RP4因子的大肠杆菌与金色链霉菌的菌丝或孢子进行杂交，这样在RP4的推动下，穿梭质粒从大肠杆菌转移到目的链霉菌中。关键词：金色链霉菌；工业生产菌株；原生质体制备和再生；pEG．介导的原生质体转化；接合转移；电转化英文摘要StudiesongenetransfersysteminStreptomycesaureofaciensindustrialstrainABSTRACTObjectiv