链霉菌基因实验操作.doc

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1、链霉菌实验操作1录入时间:2009/8/2816:09:31来源：食品科技网一、培养基、抗生素、生长因子常用抗生素及其使用浓度抗生素英文名称及缩写抗性基因贮藏液浓度(mg/ml)使用终浓度（μg/ml）链霉菌大肠杆菌MM2CMYEMELA或LB氨苄青霉素氯霉素潮霉素卡那霉素壮观霉素链霉素硫链丝菌素红霉素阿泊拉霉素Ampicillin,AmpChloramphenicol,CmlHygromycin,HygKanamycin,KmSpectinomycin,SpcStreptomycin,StrThiostrepton,ThioErythomycin

2、,EryApramycin,Amblacathygaac或aphaadAstrtsrermEaac(3)IV10025(无水乙醇配)5025505025(DMSO配)10050R10102?5010510010R－2550502510－50R－－－50－2.5－5050-1002550505025不敏感2030-50*–表示无记录或不能使用，贮存液除特别说明外均用无菌水配制*此表仅供参考！！！*R表示不敏感*Km和Am有交叉抗性，所以同时具有这两种抗性基因时应适当提高抗生素的量，并作好对照。*Hyg易见光分解，应用锡箔纸包好。*有些抗生素需要在低盐

3、的环境（如DNA培养基）下筛选效率较高，如Hyg,Km,VioLB（Luria-Bertani）培养基胰蛋白胨10g，酵母抽提物5g，NaCl5g，葡萄糖1g，蒸馏水加至1000ml，pH7.3左右（灭菌后第一次用时还要调一次）LALB中加入终浓度为1.5-2%的琼脂粉(不同的琼脂加的量不同，如青岛琼脂大概需1.5%，而华美的需要2%)。＊做蓝白斑筛选时不加葡萄糖基本培养基（MM）溶液：L-天冬酰胺0.5g，K2HPO40.5g,MgSO4·7H2O0.2g,FeSO4·7H2O0.01g,蒸馏水至1000ml将每250ml溶液分装到装有2.5g琼

4、脂的500ml三角瓶中，灭菌，使用时每瓶加入50％葡萄糖（8磅灭菌）5ml，调pH7.0。配置MM的琼脂有labagar、Iceagar(IA)R5（1L）链霉菌原生质体转化时用蔗糖103gK2SO40.25gMgCl2·6H2O10.12g葡萄糖10gDifco酪蛋白氨基酸0.1g微量元素溶液2mlOxoid酵母提取物5gTES5.73g加蒸馏水至1000ml称取5.5gDifco琼脂放入500ml三角瓶中，倒入250ml上述溶液，然后塞上塞子后8磅灭菌（114度15分种）。使用时，将培养基融化，每瓶中加入：KH2PO4(0.5%)2.5mlCa

5、Cl2·2H2O(5M)1mlL-脯氨酸(20%)3.75mlNaOH(1M)调pH至7.3对营养缺陷型菌株加入适当的营养因子（请参考《手册》）YEME(酵母膏-麦芽膏培养基)1L（液体培养链霉菌）Oxoid酵母提取物3gOxoid蛋白胨Tryptone5g麦芽提取物（BD公司原Difco公司218630）3g葡萄糖10g蔗糖＊340g蒸馏水至1000ml高压灭菌后加入：（8磅灭菌，113－114゜C，15min，自动灭菌锅一次不能灭过多东西，否则会灭不彻底。）MgCl2·6H2O(2.5M)2ml/L制备原生质体时，还要加入：甘氨酸（20%）＊2

6、5ml/L＊蔗糖的主要作用是维持链霉菌生长时的渗透压。＊甘氨酸被认为能干扰链霉菌细胞壁的形成，使菌丝体片段更短，利于溶菌，有利于外源DNA的导入。TSBY（1L）（液体培养链霉菌）Oxoid胰胨豆汤粉（TSB）30g蔗糖＊340gOxoid酵母抽提物5g蒸馏水至1000ml*不同菌株培养需要不同浓度的蔗糖，蔗糖的主要作用是维持链霉菌生长时的渗透压。MS培养基将黄豆饼粉加蒸馏水煮2到3小时，用纱布过滤得到滤液，将每250ml滤液分装到装有5g琼脂，5g甘露醇的500ml三角瓶中，10磅灭菌，使用时调pH7.2-7.3。2CMY培养基（用于井岗的接合转

7、移）可溶性淀粉10g胰蛋白胨2gNaCl1g(NH4)2SO42gK2HPO41gCaCO32g无机盐溶液*1ml琼脂20g蒸镏水1000mlPH7.2无机盐溶液(每升)FeSO4.7H2O1gMgCl.6H2O1gZnSO4.7H2O1gYMS培养基（阿维，井岗产孢）酵母抽提物4g可溶性淀粉4g麦芽糖10gCoCl..6H2O5mg琼脂20g蒸镏水1000mlPH7.2YD培养基酵母抽提物4g麦芽糖10g葡萄糖4gMgCl2gCaCl1.5g琼脂15g蒸镏水1000mlPH7.2生长因子补充物的使用浓度天蓝色链霉菌1258、J1501等都是营养缺

8、陷型菌株，培养这些菌株时一般需向培养基中补加营养因子，使用浓度如表生长因子补充物的使用浓度表化合物储存液（mg/ml）1终