链霉菌操作手册.doc

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1、链霉菌室实验操作手册（2003年）第一章培养基抗生素生长因子3常用抗生素及其使用浓度3LB（Luria-Bertani）培养基3LA3基本培养基（MM）3R5（1L）链霉菌原生质体转化时用4YEME(酵母膏-麦芽膏培养基)1L（液体培养链霉菌）4TSBY（1L）（液体培养链霉菌）4MS培养基52CMY培养基（用于井岗的接合转移）5YMS培养基（阿维，井岗产孢）5YD培养基5生长因子补充物的使用浓度5第二章DNA基本操作7大肠杆菌质粒的抽提7酶连反应7DNA片段凝胶回收7DNA纯化9E.coil总DNA的提取9链霉菌质粒DNA的小量提取（

2、还需改进）10去磷酸化处理（详见分子克隆实验指南以及Takara的CIAP使用说明）10AT克隆（详见说明书）10SouthernBlot11第三章PCR及相关技术13PCR13PCR重组（详见《PCR技术实验指南》p429重叠延伸技术）14PCR定点诱变（DpnI法）14第四章基因片段转移技术15大肠杆菌CaCl2法制备感受态细胞及DNA转化15DNA转化15大肠杆菌质粒的快速检测15接合转移（详见英文《手册》249页）16链霉菌原生质体的制备16链霉菌原生质体的转化17PCR-Targeting技术中E.coli电转化感受态的制备及

3、电转化17第五章RNA操作技术19链霉菌总RNA的抽提1927链霉菌的RT-PCR（promegaRTkit）19第六章蛋白质基本操作技术21SDS-PAGE，考马斯亮蓝染色21大肠杆菌可溶性蛋白表达及抽提（用于由IPTG诱导的表达体系）：21链霉菌总蛋白抽提：22大肠杆菌目标蛋白的诱导及总蛋白检测（含T7表达系统如BL21菌株中的pET系列表达体系）：22WesternBlot23第七章遗传作图相关技术25链霉菌孢子悬液的制备25链霉菌中NF的证明25孢子杂交25在遗传图谱上两个标记基因之间定位新的基因25第八章其他技术27链霉菌菌种

4、保藏27检测链霉菌淀粉酶的活性2727第一章培养基抗生素生长因子常用抗生素及其使用浓度抗生素英文名称及缩写抗性基因贮藏液浓度(mg/ml)使用终浓度（μg/ml）链霉菌大肠杆菌MM2CMYEMELA或LB氨苄青霉素氯霉素潮霉素卡那霉素壮观霉素链霉素硫链丝菌素红霉素阿泊拉霉素Ampicillin,AmpChloramphenicol,CmlHygromycin,HygKanamycin,KmSpectinomycin,SpcStreptomycin,StrThiostrepton,ThioErythomycin,EryApramycin,

5、Amblacathygaac或aphaadAstrtsrermEaac(3)IV10025(无水乙醇配)5025505025(DMSO配)10050R10102?5010510010R－2550502510－50R－－－50－2.5－5050-1002550505025不敏感2030-50*–表示无记录或不能使用，贮存液除特别说明外均用无菌水配制*此表仅供参考！！！*R表示不敏感*Km和Am有交叉抗性，所以同时具有这两种抗性基因时应适当提高抗生素的量，并作好对照。*Hyg易见光分解，应用锡箔纸包好。*有些抗生素需要在低盐的环境（如DNA

6、培养基）下筛选效率较高，如Hyg,Km,VioLB（Luria-Bertani）培养基胰蛋白胨10g，酵母抽提物5g，NaCl5g，葡萄糖1g，蒸馏水加至1000ml，pH7.3左右（灭菌后第一次用时还要调一次）LALB中加入终浓度为1.5-2%的琼脂粉(不同的琼脂加的量不同，如青岛琼脂大概需1.5%，而华美的需要2%)。＊做蓝白斑筛选时不加葡萄糖基本培养基（MM）溶液：L-天冬酰胺0.5g，K2HPO40.5g,MgSO4·7H2O0.2g,FeSO4·7H2O0.01g,27蒸馏水至1000ml将每250ml溶液分装到装有2.5g琼

7、脂的500ml三角瓶中，灭菌，使用时每瓶加入50％葡萄糖（8磅灭菌）5ml，调pH7.0。配置MM的琼脂有labagar、Iceagar(IA)R5（1L）链霉菌原生质体转化时用蔗糖103gK2SO40.25gMgCl2·6H2O10.12g葡萄糖10gDifco酪蛋白氨基酸0.1g微量元素溶液2mlOxoid酵母提取物5gTES5.73g加蒸馏水至1000ml称取5.5gDifco琼脂放入500ml三角瓶中，倒入250ml上述溶液，然后塞上塞子后8磅灭菌（114度15分种）。使用时，将培养基融化，每瓶中加入：KH2PO4(0.5%)2

8、.5mlCaCl2·2H2O(5M)1mlL-脯氨酸(20%)3.75mlNaOH(1M)调pH至7.3对营养缺陷型菌株加入适当的营养因子（请参考《手册》）YEME(酵母膏-麦芽膏培养基)1L（液体培养链霉