天蓝淡红链霉菌sipi

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1、天蓝淡红链霉菌SIPI作者：宫倩尚珂胡又佳朱春宝朱宝泉【摘要】柔红霉素是合成重要抗肿瘤抗生素多柔比星的前体，由微生物发酵产生。通过PCR从国内柔红霉素生产菌种天蓝淡红链霉菌SIPI-1482基因组DNA中扩增出约1080bp的dnrX部分序列，将PCR扩增片段中985bp的片段亚克隆至大肠埃希菌质粒pYG813构建了同源重组突变质粒pYG963，转化SIPI-1482原生质体并成功地敲除了dnrX基因，得到一株稳定的突变株。该突变株的发酵试验表明dnrX基因所编码的酶的功能已经被有效地阻断，对酸敏感的副产物减少，柔红霉素的产量增加了近3倍，将原野生菌改造成为多柔比星产生菌，发酵效

2、价与原野生菌株柔红霉素的发酵效价相当，为直接发酵法生产多柔比星打下了基础。【关键词】dnrX基因；多柔比星；柔红霉素；同源重组；SIPI-1482ABSTRACTDaunorubicin(DNRB)anddoxorubicin(DXRB),tportantanthracyclinesinclinics,otherapeuticagentsinthetreatmentofvariousneoplasmiasandmyelogenousleukemia.Doxorubicin,theC-14hydroxylatedderivativeofdaunorubicin,shoofanti-

3、tumoractivities,loycesfermentationandchemicalsemi-synthesis,respectively.ApartialdnrXgenefragmentinlengthof1080bpplifyiedbyPCRfromthegenomicDNAofStreptomycescoeruleorubidusSIPI-1482,thedomesticdaunorubicin-producer.Sequencealignmentindicatedthatthisfragmenthada94.8%homologyS.peucetiusATCC2905

4、0,andfurthersubclonedintoanE.colivectorpYG813toconstructthedisruptionplasmidpYG963.Afterdemethylationandalkalinedenaturation,pYG963edintoSIPI-1482byhomologousrebinationandthedisruptionofgenednrXinSIPI-1482ountofsomeacid-sensitivesubstanceandincreasetheyieldofdaunorubicinby3folds.Doxorubicin,e

5、tabolitesofthisdisruptantSIPI-1482-Q1.Theyieldofdoxorubicin,olecularedbymassspectrum,l,akesitpossiblefordirectfermentationofdoxorubicin.KEY110，S.coeruleorubidusSIPI-1482由本实验室保存。pUCm-T购自上海生工生物工程公司，pYG813为实验室构建的将安普霉素抗性基因(apr，GenBank登录号：AJ566337)克隆至pUC18的重组质粒。大肠埃希菌用LB培养基［3］，各种链霉菌菌体培养用YEME培养基，链霉菌

6、原生质体转化用R2YE培养基［4］，SIPI-1482种子及发酵培养基见3讨论GenBank中只报道了一种dnrX基因序列，起初我们欲根据该序列设计引物从SIPI-1482基因组DNA中扩增dnrX的全长序列，但未获成功。随后通过比较GenBank中相似基因的序列，并选取同源性最高的区域来设计引物成功地扩增到1080bp的部分序列，虽然接着尝试反向PCR的方法也未能得到全长序列，但利用这1080bp的部分序列已经可以进行基因阻断的操作了。根据S.peucetiusATCC29050中dnrX基因的相应片段与该PCR产物的序列同源性为94.8%来判断，可能在dnrX基因的起始位置或

7、终止处有较大的差异导致扩增未能成功。而重组子基因组DNA中dnrX基因缺失少数碱基(可能是N端69bp)造成dnrX基因的不完整，从发酵结果可以看出dnrX基因的阻断对发酵结果有很大影响，这可能是由于该酶的功能已经完全或者部分丧失，说明缺失的部分可能是酶作用的必须区域。对于能否发生同源重组，交换臂的长度是关键因素。不同菌株要求的交换臂最小长度不同，例如天蓝色链霉菌中800bp的同源交换臂就能够发生同源交换，而灰色链霉菌要求交换臂长度至少为2kb。Scotti等以411bp的交换臂