天蓝色链霉菌γ丁酸内酯信号调控机制研究

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1、密级：中国科学院大学UniversityofChineseAcademyofSciences博士学位论文2013年5月Dissectingtheregulatorymechanismof7--butyrolactone●■l·■●一．■■■S12naloroaucuoninJtreptomvcesCOPflCDlD，．ByWeishanWangADissertationSubmittedtoGraduateUniversityofChineseAcademyofSciencesInpartialfulfillmentoftherequiremen

2、tForthedegreeofDoctorofPhilosophyInstituteofMicrobiologyChineseAcademyofSciencesMay，2013学位论文原创性声明本人郑重声明：所呈交的学位论文，是本人在导师指导下独立进行研究工作所取得的成果。除文中已经注明引用的内容外，本学位论文不包含任何其他个人或集体已经发表或未发表的成果、数据或撰写过的科研成果，也不包含为获得任何教育机构的学位或证书己使用过的材料。对本论文所涉及的研究工作做出贡献的其他个人和集体，均己在文中以明确方式标明。申请学位的论文与资料若有不实之处，本人

3、愿承担一切责任。、，叼学位论文作者签名：乞即彬∥厚年甥f．，日学位论文使用授权声明本人完全了解中国科学院大学及微生物研究所关于提交、保存和使用学位论文的规定。同意研究所保存或向国家有关部门或机构送交论文的纸制版和电子版，允许论文被查阅和借阅；论文保存单位及借阅人有义务保护论文作者及单位的知识产权。本论文的成果归中国科学院微生物研究所所有；本人离所后发表、使用本学位论文或与本论文直接相关的学术成果时，第一署名单位仍然为中国科学院微生物研究所。(保密论文在解密后遵守此规定)作者签名：弓妇善日期：Ⅵ／>年，月／e日翩虢书镟日期：2．Ol3年箩月10日摘

4、要链霉菌具有强大的次级代谢能力和显著的生长周期，其中，丫．丁酸内酯介导的群体感应在触发链霉菌次级代谢生物合成和形态分化过程中起着关键作用。本论文以天蓝色链霉菌1，．丁酸内酯群体感应系统为研究对象，旨在阐明该调控系统的开启和关闭调控机制，为进一步工程应用该调控系统提高抗生素产量建立理论基础。实验室前期工作表明在天蓝色链霉菌中假1，．丁酸内酯受体ScbR2能够结合kasO启动子。本工作首先对ScbR2在kasO启动子的结合序列进行footprinting分析，发现ScbR2在kasO启动子的结合序列同1，．丁酸内酯受体ScbR的结合序列OB重合。由于

5、信号分子SCBl合酶基因scbA启动子也存在这一顺式序歹lJ(siteA)，于是通过体外EMSA实验、footprinting实验和体内荧光定量PCR、异源双质粒报告基因验证，证实ScbR2确实通过直接结合scbA启动子的siteA位点抑制该启动子的转录。进一步用LC．MS／MS对野生株和ScbR2缺失株及回补株的信号分子SCBl定量分析表明，在ScbR2缺失株SCBl在整个生长时期都表现为可检测浓度，而在野生株和回补株SCBl信号分子只在转变期检测到。因此推断ScbR2负责在了转录水平上终止群体感应信号分子的合成；继续对scbR2和群体感应基因

6、scbA／scbR的比较转录时序分析表明，ScbR2启动时间恰好负责了群体感应信号的关闭。为了证明该机制的保守性，委内瑞拉链霉菌假1，．丁酸内酯受体JadR2关闭群体感应信号分子合酶基因jadWl启动子的角色也得到充分验证，并进一步分析发现，ScbR2和JadR2在相应启动子的结合序列比较保守，这一保守序列在其他链霉菌的信号分子合酶基因启动子也普遍存在。因此，在链霉菌中，假1，．丁酸内酯受体在转录水平上执行终止信号分子合成的角色具有普遍性。摘要天蓝色链霉菌群体感应基因scba／scbR只在特定时序开启，在灰色链霉菌也有类似报道。所以，在链霉菌生长

7、早期也应该存在一种控制机制抑制群体感应的启动。为了筛找天蓝色链霉菌的群体感应早期抑制蛋白，我们首先通过合成生物学遗传电路原理在大肠杆菌建立目标启动子的抑制蛋白筛选Biosensor；然后以scbA基因启动子为靶启动子，对天蓝色链霉菌64个TetR家族调控蛋白进行建库筛选，最终筛得4个未知抑制蛋白。其中将CprA和CprB进行重组表达纯化，通过EMSA实验表明CprA和CprB确实结合scbA启动子；进一步转录时序分析发现，这两个蛋白在生长早期有较高的转录，其中CprB较显著。所以我们初步推测CprA和CprB在天蓝色链霉菌生长早期，起着抑制群体感

8、应启动的角色。天蓝色链霉菌kasO启动子受到ScbR和ScbR2两个蛋白的抑制，同时还能够被链霉菌看家sigma因子HrdB识别，为了开