中国人肝癌和肺癌细胞cpr技术的建立和耐药相关基因的初步筛选

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1、分类号密级硕士学位论文题目：中国人肝癌和肺癌细胞CPR技术的建立和耐药相关基因的初步筛选英文并列题目：ConstructionofChineseliverandlungcancercellCPRtechniquesandpreliminaryscreeningofresistantgenes研究生：傅倩云专业：药学研究方向：药理学导师：金坚教授指导小组成员：朱瑞宇博士学位授予日期：答辩委员会主席：许正宏江南大学地址：无锡市蠡湖大道1800号二○一五年六月II摘要摘要肿瘤的耐药状态是化疗失败的主要原因，解析其耐药机理来指导药物的个性化治疗是临床急需解决的瓶颈问题。论文采用了病毒循环包装法（C

2、yclicalPackagingRescue，CPR），对来源于中国人肺腺癌细胞株LTEP-a-2和中国人肝癌细胞株Bel-7405的cDNA文库进行耐药基因的初步筛选，为解释肿瘤耐药机制提供了依据，也为肿瘤精准化治疗方案的确立提供了新的思路。论文的主要研究结果如下：1.鉴于种属的差异性，论文以中国人肺腺癌细胞株LTEP-a-2和中国人肝癌细胞株Bel-7405为研究材料，采用SMART（switchingmechanism5’endofRNAtranscript）法构建其全长的cDNA文库，以期达到具有代表中国人肺癌和肝癌基因特征的目的。所建7的cDNA文库的库容量达到了10数量级，文库

3、片段大小分布在0.4-2kb之间，保障了从文库筛选耐药相关基因完整性的目的。2.以Phoenix™逆转录病毒表达试剂盒中的包装细胞Phoenix™293T为宿主细胞，将cDNA文库片段插入pLIB载体的LTR之间，形成逆转录病毒cDNA文库。转染宿主细胞，构建含cDNA片段多样性的逆转录病毒表达系统。实时定量PCR（RT-PCR）法5测得含cDNA片段的逆转录病毒滴度约为1.0×10copies/μL，满足耐药基因筛选的库容量需求。以干预药物阿霉素（ADM）、敏感的小鼠成纤维细胞（NIH-3T3）为材料，含cDNA片段多样性的逆转录病毒感染细胞，药物干预条件下收集存活细胞；将带有逆转录病毒

4、结构基因pGP和pE-eco的质粒共转染存活细胞，包装出含有目的cDNA片段的逆转录病毒，形成可循环包装的病毒展示cDNA片段的方法，即CPR平台。提取存活细胞基因组DNA，PCR鉴定基因片段的多样性，验证CPR技术的可行性。3.以NIH-3T3为研究材料，采用CPR将多样性cDNA片段通过逆转录病毒展示在NIH-3T3中；定量干预药物ADM筛选后，从存活细胞中获得含目标基因的逆转录病毒。PCR分析和鉴定目标基因后，再将收集的含目标基因的逆转录病毒感染工作细胞NIH-3T3，形成CPR筛选目标基因的循环系统。论文研究获得七个基因，通过体外药物敏感实验验证发现Bcl-6相关抗凋亡基因（BAG

5、6）、乙醛脱氢酶2（ALDH2）、人长非编码RNA（BCYRN1）和snaR非编码小RNA（H8iiisnaR-A）四个基因与ADM耐药相关联。论文通过改进建立的中国人肺腺癌细胞株LTEP-a-2和肝癌细胞株Bel-7405cDNA文库CPR技术平台，筛选获得了耐ADM的相关基因，提升了分析肿瘤耐药基因的高通量筛选手段。初步筛选获得的与耐ADM相关的基因，尚需采用其他技术进行进一步鉴定，以达到确认这些基因在肿瘤耐药机制中作用的目的。关键词：肿瘤；cDNA文库；CPR；耐药基因IAbstractAbstractDrugresistanceoccurstothefailureoftumorch

6、emotherapy.Therefore,analysingdrugresistantmechanismtoguidepersonalizedcancertherapyisclinicallyurgentbottlenecks.ThepaperusedCyclicalPackageRescue(CPR)platformtoscreendrugresistantgenesfromChinesehumanlungadenocarcinomacelllinenamedLTEP-a-2andlivercancercelllinenamedBel-7405,whichprovidesthebasis

7、forexplainingdrugresistantmechanismandprecisetumortreatmentprogram.Themainstudyresultsareasfollows:1.Giventhespeciesdifference,ChinesehumanlungadenocarcinomacelllinenamedLTEP-a-2andlivercancercelllinenamedBel-740