清热抗毒口服液制备工艺研究及其质量标准的建立

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授予单位代码10089学号或申请号13588HebeiMedicalUniversity硕士学位论文在职科学学位清热抗毒口服液制备工艺研究及其质量标准的建立学位申请人：杨静导师：查建蓬教授专业：药物分析学二级学院：药学院2015年3月 河北医科大学学位论文使用授权及知识产权归属承诺本学位论文在导师(或指导小组）的指导下，由本人独立完成。本学位论文研究所获得的研究成果,其知识产权归河北医科大学所有。河北医科大学有权对本学位论文进行交流、公开和使用。凡发表与学位论文主要内容相关的论文,第一署名为单位河北医科大学，试验材料、原始数据、申报的专利等知识产权均归河北医科大学所有。否则，承担相应法律责任。研究生签名导师签M学院领导盖章rM年5月曰河北医科大学研究生学位论文独创性声明本论文是在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果，除了文中特别加以标注和致谢等内容外,文中不包含其他人已经发表或撰写的研究成果，指导教师对此进行了审定。本论文由本人独立撰写,文责自负。 目录中文摘要…………………………………………………………………...….1英文摘要…………………………………………………...………………….4研究论文清热抗毒口服液制备工艺研究及其质量标准的建立引言…………………………………………………...………………….8第一部分清热抗毒口服液制备工艺研究……………………….….……..9前言…………………………………………………….…………..…….9材料与方法………………………………….……….……………..……9结果………………………………………………….………………….11附图………………………………………………….………………….13附表………………………………………………………..…………....15讨论………………………………………………………………….….16小结……………………………………………………………………..17参考文献………………………………………………………………..18第二部分清热抗毒口服液质量标准的建立…………………………..…19前言……………………………………………………………………..19材料与方法…………………………………….……………………….19结果……………………….………………………………….…………27附图……………………………………………………………..………30附表…………………………………………………………………..…34讨论………………………..……………………………………………38小结…………………………………………….….……………………39参考文献…………………………………..……………………………40结论…………………………………………….…………………………….40综述手足口病治疗方法、预防及治疗药物质量控制方法研展………………………………………………………………..…41致谢……………………………………………………………………..……51个人简历………………………………………………………………..……52 中文摘要清热抗毒口服液制备工艺研究及其质量标准的建立摘要手足口病是由肠道病毒引起的传染病，多发生于5岁以下儿童，可引起手、足、口腔等部位的疱疹，严重者可导致死亡。近年来，手足口病频繁多发，呈上升趋势，已成为危害儿童身体健康的急性传染病之一。目前国内外尚无预防用药以及西药特效抗肠道病毒药物，主要是对症处理和脏器支持治疗。与西药相比，中药制剂抗病毒作用虽然缓慢，但是安全系数高，疗效确切，功效全面，无明显的副作用。针对这种现状,更加凸显出中医药辨证治疗灵活性、有效性和针对性的优势，继承和发扬中医药治疗的优势和特色对于提高手足口病的临床疗效至关重要。经过长期临床实践，清热抗毒口服液具有良好的临床效果。但因传统煎剂口感稍差、服用量大，不便于小儿服用。本课题旨在探索一种治疗小儿手足口病的纯中药制剂——清热抗毒口服液的制备工艺的优化与质量标准的建立，以及质量控制的方法。通过正交设计对清热抗毒口服液的提取浓缩工艺进行优选，提高成方药材的煎出率，避免了传统煎剂的弊端，提高了药物的生物利用度。通过探索清热抗毒口服液的质量标准,建立以盐酸小檗碱为主要活性成分为质量控制指标的分析方法。通过提取工艺的优选及质量标准的建立，为手足口的临床治疗提供新的思路方法，改变目前西医治疗手足口病无特异性方药的现状，并为降低重症手足口病的发生率提供有效安全的药物。第一部分清热抗毒口服液制备工艺研究目的：通过加权综合评分法和正交设计试验优选处方药材最佳提取工艺。确定清热抗毒口服液的最佳制备工艺流程。方法：采用正交设计方法，以相对密度与盐酸小檗碱的薄层扫描含量为考察指标，考察提取时间、加水量（倍）、提取次数对提取效果的影响，综合评分法优化实验数据，以确定最佳提取工艺。结果：以相对密度、盐酸小檗碱含量为考察指标，各因素对综合评分的影响：加水量对盐酸小檗碱的提取影响最大，提取次数次之，提取时间对盐酸小檗碱的提取影响最小。处方药材加水煎煮2次，第一次提取加1 中文摘要10倍量水，煎煮1小时，第二次提取加8倍量水，煎煮1小时，合并煎液，滤过，滤液浓缩至相对密度为1.05-1.08的溶液，离心，加入适量的糖浆和苯甲酸钠，搅匀，灌装，灭菌，即得。结论：通过引入加权综合评分法和正交设计优选出的制备工艺流程合理、生产过程简单，节约成本，可操作性强，切实可行。关键词：清热抗毒口服液,制备工艺,薄层色谱（TLC）第二部分清热抗毒口服液质量标准的建立目的：建立采用高效液相色谱法测定清热抗毒口服液中盐酸小檗碱的含量测定方法。建立清热抗毒口服液的质量标准，为清热抗毒口服液提供以盐酸小檗碱为主要活性成分作为质量控制指标的分析方法。方法：（1）对处方药材白茅根、钩藤、黄连进行了薄层色谱鉴别。（2）高效液相色谱条件的优化：选择合适的固定相、流动相，以及检测方法等色谱条件，以盐酸小檗碱色谱峰与其他峰完全分离。（3）系统适应性试验：在已确定的色谱条件下，考察待测成分的色谱峰分离度、理论塔板数、对称因子等是否符合要求。（4）专属性试验：检验在色谱条件下阴性供试品对样品是否有干扰。（5）制备标准曲线：进行最低检测限试验、精密度试验、稳定性试验和重复性试验。（6）加样回收率试验。（7）样品含量测定。（8）清热抗毒口服液质量标准的建立。结果：（1）白茅根、钩藤、黄连的薄层色谱鉴别阴性无干扰，列入正文，蒲公英的薄层鉴别阴性有干扰，故不列入正文。（2）提取方法：以盐酸-甲醇（1：100）为溶剂，超声40min为最佳提取方法。（3）高效液相色谱条件的优化：采用色谱柱为岛津C18（4.6×150mm，5μm）；以乙腈-0.05mol/L磷酸二氢钾溶液（25:75）为流动相进行洗脱；检测波长为265nm；流速为1.0ml/min。（4）系统适应性试验：在此色谱条件下，盐酸小檗碱色谱峰的理论塔板数大于3000，与相邻色谱峰的分离度大于1.5。（5）专属性试验：在上述色谱条件下进样，阴性对照品对样品无干扰。（6）标准曲线的制备：盐酸小檗碱进样量在0.05-5µg/ml范围内呈现良好的线性关系，相关系数为0.9999。（7）最低检测限试验：盐酸小檗碱的最低检测限为0.025µg/ml。（8）精密度试验：盐酸小檗碱的有效峰面积的RSD为0.13%。（9）稳定性试验：盐酸小檗碱的有效峰面积的RSD为2 中文摘要0.6%，样品在8小时内稳定。（10）重复性试验：以盐酸小檗碱的峰面积计算所得重现性试验的RSD为1.8%。（11）加样回收率试验：盐酸小檗碱的平均加样回收率为101%，RSD为1.86%。（12）样品含量测定：在所建立的色谱条件下，对不同批次的清热抗毒口服液中盐酸小檗碱的含量进行测定，并计算样品中有效成分的含量。结论：采用高效液相色谱法测定清热抗毒口服液中盐酸小檗碱含量。该方法具有分析时间短，专属性强，线性范围宽，精密度和准确度良好等优点，可以用于清热抗毒口服液的质量控制，为保证制剂质量提供科学、可行的质量控制方法。关键词：清热抗毒口服液,质量标准研究,盐酸小檗碱,HPLC3 英文摘要StudyonPreparationTechnologyofQingrekangduOral’LiquidandtheEstablishmentofItsQualityStandardABSTRACTHandfootandmouthdisease（HFMD）iscausedbyentervirusinfection,occursmoreofteninchildrenunder5yearsofage,andcancauseherpesinhand,foot,mouthandotherpartsofthebody,severecasescanleadtodeath.Inrecentyears,handfootandmouthdiseasefrequentlybrokeout,upwardtrenddisplayed,andithasbecomeoneoftheacuteinfectiousdiseaseswhichaffectchildren'sphysicalhealth.Currently,thereisnopreventivemedicineandpotentwesternmedicineagainstintestinalvirusmedicine,mainlysymptomatictreatmentandorgansupporttherapy.Comparedwithwesternmedicine,althoughtheeffectoftraditionalChinesemedicinepreparationofantiviralisslow,thesafetyfactorishigh,thecurativeeffectisaccurate,andtheeffectsarecomprehensive,noobvioussideeffects.Inviewofthissituation,themorehighlightsofTCMsyndromedifferentiationandtreatmentofflexibility,effectivenessandpertinenceofadvantageareneeded,theinheritanceandcarryforwardoftheadvantagesandcharacteristicsofthetraditionalChinesemedicinetreatmentareofthevitalroleforimprovingtheefficacyofhandfootandmouthdisease.Throughthelong-termclinicalpractice,Qingrekangduoralliquidhasagoodclinicaleffect.Butbecausethetraditionaldecoctionoftasteisabitpoor,thedosageislarge,notconvenientforchildrentotake,therefore,thisprojectaimstoexploretheestablishmentofapureChinesemedicine–QingrekangduoralliquidpreparationfortreatingpediatricHFMDpreparationtechnologyoptimizationandqualitystandards,andqualitycontrolmethod.ByOptimizingtheorthogonaldesignextractionandconcentrationprocessofQingrekangduoralliquid,toimprovethemedicinalherbsdecoctingrate,avoidthedisadvantagesoftraditionaldecoction,improvethebioavailabilityofthedrug.ByexploringthequalitystandardofQingrekangduoralliquid,toestablishthe4 英文摘要analyticalmethodwithberberinehydrochloride,whichisthemainactiveingredientforqualitycontrolindex.Throughtheestablishmentofoptimizationandqualitystandardofextractionprocess,toprovidenewideasforclinicaltreatmentofhandfootandmouth,changethepresentstateofwesternmedicinetreatmentofhandfootandmouthdisease,whichhasnospecificprescription,andtoprovidesafeandeffectivedrugstoreducetheoccurrenceofseverehandfootmouthdiseaserate.PartOneStudyonPreparationTechnologyofQingrekangduOralliquidObjective：Bythecomprehensiveweightedscoremethodandorthogonaldesigntest,todeterminethebestextractionprocessoptimizationprescriptionmedicinesandtoestablishtheoptimalpreparationprocessofQingrekangduoralliquid.Methods:Byusingorthogonaldesignmethod,andsettherelativedensityandTLCScanningDeterminationofberberinehydrochlorideastheindexes,toprobetheinfluenceofextractiontime,theamountofwater(Times),effectofextractiontimesonextractioneffect,andsynthesizethescoringmethodtooptimizetheexperimentaldata,determinetheoptimumextractionprocess.Results:Settherelativedensityandberberinehydrochlorideastheindexes,theinfluencesofvariousfactorsonthecomprehensivescore:theeffectsoftheamountofwaterextractonberberinehydrochloridearemaximum;theextractiontimesfollowed,theeffectsofextractiontimeontheextractionofberberinehydrochlorideareminimum.Prescriptionmedicinedecocting2times,thefirstextractionwith10timesamountofwater,boiling1hours,extractingforsecondtimeswith8timesamountofwater,boiling1hours,decoction,filtration,thefiltratewasconcentratedtoarelativedensityof1.05-1.08solution,centrifuging,addingproperamountofsyrupandsodiumbenzoate,stirwell,filling,sterilization,andobtained.Conclusion:Theintroductionoftheweightedcomprehensiveevaluationmethodandtheorthogonaldesigncanoptimizethereasonablepreparationprocess,andmaketheproductionprocesssimple,savethecost,enhancethe5 英文摘要operability,anditisfeasible.Keywords:Qingrekangduoralliquid,preparationprocess,TLCPartTwoEstablishmentofQualityStandardofQingrekangduoralliquidObjective:ToestablishthemethodforcontentdeterminationbyhighperformanceliquidchromatographymethodforthedeterminationofberberinehydrochlorideinQingrekangduoralliquid.ToestablishaqualitystandardforQingrekangduoralliquid,provideanalysismethodwithberberinehydrochloride,whichisthemainactiveingredient,asthequalitycontrolindexofQingrekangduoralliquid.Methods：(1)Distinguishtheprescriptiondrugcogongrassrhizome,uncaria,CoptisbyTLC.(2)Optimizationofthechromatographicconditions:selecttheappropriatestationaryphase,mobilephase,andthedetectionmethodofchromatographicconditions,withberberinehydrochloridepeaksandtheotherpeaksseparatedcompletely.(3)Systemsuitabilitytest:undertheaboveconditions,todeterminewhetherthechromatographicpeakcomponentseparationdegree,thenumberoftheoreticalplates,symmetricfactormeettherequirements.(4)Specificitytest:Testwhetherthenegativesamplesareinterferentialunderthechromatographicconditions.(5)Preparationofstandardcurve:theminimumdetectionlimittest,precisiontest,stabilitytestandrepeatabilitytest.(6)Recoverytest.(7)sampledetermination.(8)theestablishmentofqualitystandardofQingrekangduoralliquid.Results:(1)TLCidentificationofcogongrassrhizome,uncariaandCoptisisnegativeinterferencefree,includedinthetext,TLCidentificationofdandelionhasnegativeinterference,soitisnotincludedinthetext.(2)Methods:extractionwithhydrochloricacid-methanol(1:100)assolvent,ultrasonic40minforthebestextractionmethod.(3)Optimizationofthechromatographicconditions:chromatographiccolumnsfortheSHIMADZUC18(4.6*150mm,5μm);acetonitrile-0.05mol/Lpotassiumdihydrogenphosphate(25:75)asmobilephaseelution;thedetectionwavelengthwas6 英文摘要265nm;theflowratewas1.0ml/min.(4)Systemsuitabilitytest:undertheaboveconditions,thenumberoftheoreticalplateofberberinehydrochlorideofchromatographicpeakismorethan3000,andtheadjacentchromatographicpeakseparationdegreeisgreaterthan1.5.(5)thespecificitytest:undertheabovechromatographicconditions,thenegativecontrolproductwithoutinterferenceforthesamples.(6)preparationofstandardcurve:agoodlinearrelationshipintherangeof0.05-5µg/mlsampleamountofberberinehydrochlorideshowed,thecorrelationcoefficientis0.9999.(7)theminimumdetectionlimittestofberberinehydrochloride:minimumdetectionlimitwas0.025µg/ml.(8)theprecisiontest:theeffectivepeakareaofBerberineHydrochloridebyRSDwas0.13%.(9)stabilitytest:effectivepeakareaofBerberineHydrochloridebyRSDwas0.6%,thesamplein8hoursstability.(10)therepeatedtest:BerberineHydrochloridebypeakareacalculatedrepeatabilitytestofRSDwas1.8%.(11)recoverytest:berberinehydrochlorideandtheaveragerecoverywas101%,RSDwas1.86%.(12)sampledetermination:undertheestablishedchromatographicconditions,todeterminethethecontentofberberinehydrochlorideQingrekangduoralliquidfromdifferentbatchesofdetermination,andcalculatethecontentofeffectivecomponentsinthesample.Conclusion:DeterminethecontentofberberinehydrochlorideinQingrekangduoralliquidbyHPLC.Themethodhasshortanalysistime,strongspecificity,widelinearrange,goodprecisionandaccuracyandotheradvantages,andcanbeusedforthequalitycontrolofQingrekangduoralliquid,providesthequalitycontrolmethodwithscientificandfeasiblewayforensuringthequalityofpreparation.Keywords:Qingrekangduoralliquid,studyonthequalitystandard,berberinehydrochloride,HPLC7 研究论文清热抗毒口服液制备工艺研究及其质量标准的建立引言清热抗毒口服液由石家庄市第五医院名中医根据多年临床经验研制的经验方，属于新药。由石膏、白茅根、钩藤、黄连、等十位中药构成（因本制剂已申请专利保护，故处方不便透露。），因本制剂直接针对小儿手足口症的典型病理特点用药，内外兼治，从根本上解决小儿高热、抽搐及手足口疱疹的症状，减少并发症的发生，在临床上取得较好的效果。处方中生石膏，归肺胃经，具有敛疮退热之功效，可治疗溃疡及高热神昏的症状，其意在退热为先，避免因高热引起的神经系统性的危害，影响智力发育。处方中钩藤，归肝、心经，具有清热平肝，熄风止痉的功效。抽搐，从中医临床角度分析，此症状属于肝，心经的典型症状，钩藤熄风止痉的功效特点，能够很好的治疗小儿惊风及夜啼。处方中黄连具有清热燥湿，泻火解毒之功效，为处方中主要药效成分之一。板蓝根、蒲公英和黄连的共同功效为清湿热、解热毒。邪毒循经，熏蒸口舌，则口腔疱疹、口痛、流涎；邪热熏蒸四肢，则手足疱疹。以上三种中药的应用旨在消肿散结，解毒疗疮，从根本上消除引发疱疹的内在诱因。因方中多味药属性苦寒，易伤脾胃，故成方中加入藿香、升麻佐制寒湿，行化湿和胃，升举阳气之功，并且升麻同时兼具发表透疹的功效，减少上述药物的副作用。应用白茅根、丹皮和绿豆意在调和诸药的同时兼有清热散瘀，消肿止渴的作用。本课题主要在传统提取工艺的基础上进行新的尝试，探索加权综合评分法和正交设计优选药材提取浓缩的最佳工艺，提高了传统煎剂的煎出率，加强了制剂的有效性，改善了口感，提高了小儿用药的依从性，并建立清热抗毒口服液的质量标准，为控制清热抗毒口服液的质量提供科学的参考依据，亦为临床应用提供科学的参考依据。8 研究论文第一部分清热抗毒口服液的制备工艺研究前言本课题主要在传统工艺的基础上进行了新的改进，引入了加权综合评分法和正交设计法优化提取浓缩最佳工艺，提高了药材的煎出率，制剂的有效性，避免了传统煎剂的弊端，提高了药品的有效性，节约了生产成本，简化了制备工艺，适用于批量生产。在传统提取工艺的基础上通过新的技术和方法的使用，探索制备的工艺，为节约生产成本提供科学的参考依据，为确保清热抗毒口服液的有效性提供参考。材料与方法1仪器与试剂薄层色谱扫描仪(CAMAGTLCSCANNER3)；比重瓶；SartoriusBS124S电子天平（德国赛多利斯）；KQ-100E型超声波清洗器（型号：KQ-100E，昆山市超声仪器有限公司）；电热恒温水浴锅（上海东星试验设备有限公司）；离心机（型号：800，4000r/min，江苏正基仪器有限公司）盐酸小檗碱对照品（中国药品生物制品检定所，批号：110713-201212），甲醇（批号：20131013）、乙酸乙酯（批号：20131002）、丁酮（批号：20130120）、甲酸（批号：20130312）均为分析纯，水为纯化水。2方法2.1提取工艺路线的设计本课题主要在传统工艺的基础上进行了新的改进，采用了加权综合评分法和正交设计法优化提取、浓缩最佳工艺，提高了处方药材的煎出率，为制剂的安全有效提供了保障，便于制剂的质量控制。9 研究论文2.1.1正交设计法正交设计法主要是应用正交表来进行合理的试验安排，处理多因素筛选实验并筛选较好试验条件和因素的一种设计方法。他利用从试验的全部水平组合中，挑选有代表性的水平组合进行试验，通过对这部分水平组合的试验结果的分析，了解全部试验结果的情况，找出最优的水平组合。它具有以下优点：高效率；操作简便、试验次数少、试验结果准确、可靠；多因素筛选设计；均匀分散，整齐可比。正交设计为筛选设计，通过试验研究可以确定最佳的实验方案，从而获得较合理的提取工艺。2.1.2加权综合评分法加权综合评分法是将多指标试验结果，根据对预期影响大小赋予不同权重，进行加权求和从而转化为单一指标进行评价的一种方法。这种分析方法既可根据各指标的贡献大小进行权重分配，又保证了数据指标的全面性。本方法具有可靠、客观、合理等优点，保证优化提取工艺更加科学可信。本试验选取影响清热抗毒口服液提取的因素为提取时间、加水量和提取次数，每个因素设置3个不同的水平，参考指标选取制剂中主要有效成分盐酸小檗碱的含量和浓缩液的相对密度。2.1.3薄层色谱扫描法薄层色谱扫描法是对薄层色谱扫描，并进行定量检测分析的一种方法。本试验采用薄层色谱扫描法对制剂中盐酸小檗碱的含量进行测定，作为提取浓缩工艺正交设计的一个重要指标。（1）供试品溶液的制备：按正交因素水平表设计方法，进行9次试验，分别用盐酸-甲醇（1：100）混合溶液提取后，超声处理40min，滤过，滤液蒸干，残渣加1ml盐酸-甲醇（1：100）混合溶液使溶解，作为供试品溶液。（2）对照品溶液的制备：精密称取盐酸小檗碱对照品适量，置100ml容量瓶中，加入盐酸-甲醇（1：100）混合溶液使溶解，制成浓度为90μg/ml的盐酸小檗碱对照品溶液，定容即得。（3）阴性溶液的制备：按处方比例，称取除黄连外其余药材，按供试品的制备工艺制得空白样品，并按供试品溶液制备方法制得空白溶液，作为阴性对照溶液。（4）测定法：本试验采用单波长扫描；狭缝大小为8.0×0.22mm；Hg灯，10 研究论文对点样层析后的供试品、盐酸小檗碱及阴性的各斑点分别在λS=366nm进行扫描，测定，计算含量，即得。2.2清热抗毒口服液提取工艺研究（1）吸水率考察称取选净的处方量的石膏、白茅根、钩藤、蒲公英、黄连等十味药材共65g,加入冷水650ml，隔15分钟观察药材浸透情况，60分钟后药材全部浸透，滤出未被吸收的水，称重，计算吸水率为123%。（2）提取浓缩工艺条件考察选取了对提取物收率影响较大的（A）提取时间、（B）加水量、（C）提取次数为考察因素，药材全部为饮片，以相对密度与盐酸小檗碱含量为4考察指标，按如下水平以L9（3）表进行试验。结果采用综合评分法分析，根据相对密度和盐酸小檗碱含量在本实验中所占的程度，拟采用相对密度占20%，盐酸小檗碱含量占80%的判断标准进行评分。从正交结果可见：以相对密度、盐酸小檗碱含量为考察指标，各因素对综合评分的影响大小依次为：加水量>提取次数>提取时间。即加水量对盐酸小檗碱的提取影响最大，提取次数次之，提取时间对盐酸小檗碱的提取影响最小。方差分析：对各因素影响大小的显著性进行了检验，结果见表3。经方差分析可知，在三个因素中，提取次数有较大影响，考虑到节约成本，故选择提取两次；加水量有显著性影响，故选择加10倍量水，考虑到药材的吸水率为123%，所以加水量选择第一次10倍量水，第二次选择加8倍量水；提取时间影响最小且提取时间60分钟的相对密度较高，所以选择每次提取60分钟。经过优选后确定的提取工艺为：A2B1C2，即提取二次，第一次加10倍量水，提取60分钟；第二次加8倍量水，提取60分钟。结果1药材的提取工艺研究1.1提取工艺方法设计本提取工艺采用了正交设计法和加权综合评分法优选药材的提取工11 研究论文艺，取得较好的效果。1.2加权综合评分法和正交设计法优选清热抗毒口服液药材提取工艺。1.3薄层色谱扫描法测定制剂中盐酸小檗碱的含量，直接点样测定，该方法简便,分离效果良好，灵敏度高,重现性好,专属性强,是控制本制剂内在质量的较理想含量测定方法。结果见Fig.1，Fig.2，Fig.3。2提取条件的研究2.1吸水率的研究按比例称取处方量药材,加入10倍量水，隔15分钟观察药材浸透情况，60分钟后药材全部浸透，计算吸水率为123%。2.2提取浓缩工艺的正交试验设计选取对提取物收率影响较大的提取时间、加水量、提取次数为考察因94素，以相对密度与盐酸小檗碱含量为考察指标，以L（3）表进行试验。采用综合评分法进行分析，根据相对密度和盐酸小檗碱含量在本实验中所占程度，以相对密度占20%，盐酸小檗碱含量占80%的判断标准进行综合评分。2.3正交试验结果各因素对综合评分的影响大小依次为：加水量>提取次数>提取时间。即加水量对盐酸小檗碱的提取影响最大，提取次数次之，提取时间对盐酸小檗碱的提取影响最小。结果见Table1、Table2。2.4方差分析结果在三个影响因素中，提取次数虽有较大影响，考虑到节约成本，故选择提取两次；加水量有显著性影响，故选择加10倍量水，考虑到药材吸水率的因素，所以加水量选择第一次10倍量水，第二次选择加8倍量水；提取时间影响最小并且提取时间为60分钟的相对密度较高，所以选择每次提取60分钟。结果见Table3。2.5清热抗毒口服液提取工艺的确定经过优选后确定的提取工艺为：A2B1C2，即提取二次，第一次加10倍量水，提取60分钟；第二次加8倍量水，提取60分钟。12 研究论文附图Fig.1TLCscanningchartofberberinehydrochloridereferencesubstancesFig.2TLCscanningchartofberberinehydrochloridesamples13 研究论文Fig.3TLCscanningchartofnegativesample14 研究论文附表Table1factorsandlevelsoforthogonaldesignoftheextractionprocessFactorLevelAExtractionBTheamountofCExtractiontimestime（min）water（Times）11201012608233063Table2orthogonaldesignextractionprocessoptimizationresultsRelativeContentScoreNumberABCDdensity（%）(ug/ml)111111.06545.01271.488212221.07521.96044.975313331.09523.46047.076421231.08569.08499.727522311.10015.23537.642623121.05044.50070.622731321.09823.10246.716832131.07011.74033.050933211.08034.15659.189K154.51372.64458.38756.106K269.33038.55667.96454.104K346.31858.96243.81159.951R23.01234.08824.1535.847Note:thescore(%)=(relativedensity/relativedensitymaximum*0.2+content/contentmaximum*0.8)*100%15 研究论文Table3AnalysisofvarianceforextractionprocessSourceofsumofsquaredegreesvaluecriticalvalueSignificantvarianceofdeviations(i)offreedomofFofFA816.258215.40919.000B1765.603233.3319.000*C887.494216.75419.000Deviation52.97Note:F0.05(2,2)=19.000,P<0.05*,showedthattherewassignificantdifference.16 研究论文讨论1在处方药材提取工艺中引入加权综合评分法加权综合评分法是由多指标试验进行分析的方法,根据各项指标在试验中的重要性,确定其所占的权重,将多指标的试验结果化为单指标的试验结果——综合加权评分值,从而按单指标进行分析并对方案进行综合选优的一种方法。加权综合评分法不仅在中药材提取方面，而且在生活中的建筑领域和工程技术等方面得到广泛应用。本课题将加权综合评分法作为优选提取工艺试验条件的方法，优选出的工艺参数合理，并且操作简单，所需做的实验次数较少，故此法可操作性强，可作为清热抗毒口服液提取浓缩工艺优选方法。2综合评分法评分标准的选择本试验采用综合评分法分析，根据Table2可知，在提取浓缩工艺选取的二个参考指标中，相对密度在各组试验中变化不大，而该制剂中主要药效成分盐酸小檗碱含量受试验条件的影响较大，故根据相对密度和盐酸小檗碱含量在本试验中所占比重的程度，采用相对密度占20%，盐酸小檗碱含量占80%的判断标准进行评分。3检测波长的选择参照药品标准和测定方法，盐酸小檗碱在265nm和366nm下分别检测，在检测波长366nm下斑点清晰、扫描图谱分离度较好，故确定检测波长为366nm。4含量测定方法的选择参照《中国药典》2010年版(一部)中药制剂项下的盐酸小檗碱含量测定波长及提取溶剂等实验条件,采用薄层扫描法测定制剂中盐酸小檗碱的含量。本试验通过薄层色谱扫描法建立的含量测定方法，作为提取浓缩工艺综合评分的一个重要指标。该方法节约成本，操作简便，科学合理，准确，能有效评价盐酸小檗碱含量及制剂的质量，为工艺参数的选取提供科学的依据。5正交设计石膏的含量测定以石膏的含量为考察指标，按Table1正交因素水平表设计方法，以17 研究论文4L9（3）表进行9次试验，结果表明各因素对石膏的含量影响均不大，石膏的含量测定结果相差不大，不存在显著差异。故未将石膏的含量作为制备工艺的考察指标。小结经过对清热抗毒口服液中盐酸小檗碱薄层色谱扫描试验条件的摸索，通过加权综合评分法结合正交设计优选研究方法，根据各因素对该制剂提取工艺的影响：加水量对盐酸小檗碱的提取影响最大，提取次数次之，提取时间对盐酸小檗碱的提取影响最小。经过优选后确定的提取工艺为提取二次，第一次加10倍量水，提取60分钟；第二次加8倍量水，提取60分钟。经过提取工艺条件的优选和新的科学方法的引入，从而确立了清热抗毒口服液的最佳制备工艺流程。参考文献1中华人名共和国药典委员会.《中国药典》（2010年版,一部）[M].北京:中医药科技出版社,20102谢纪珍,梁瑞雪.薄层扫描法测定脑通灵颗粒中盐酸小檗碱含量.齐鲁药事,2008.27(7):407-4093刘弘,王俊杰,张玲昂,赵京生.加权综合评分法优化心得宁口服液提取工艺的研究[J],2014,1(1):76-7718 研究论文第二部分清热抗毒口服液质量标准的建立前言清热抗毒口服液由石家庄市第五医院名中医根据多年临床经验研制的经验方，属于新药。由石膏、白茅根、钩藤、黄连等十位中药构成（因本制剂已申请专利保护，故处方不便透露。），具有清肝经热，祛湿解毒、平肝止痛的功能。可用于治疗疱疹、抽搐、发热等急性感染症状。为了控制制剂质量，本课题探索并建立清热抗毒口服液的质量标准，分别以白茅根、钩藤、盐酸小檗碱为指标对白茅根、钩藤、黄连药材进行了薄层色谱鉴别，以盐酸小檗碱为指标成分建立了含量测定方法，并进行方法学考察，为控制清热抗毒口服液的质量提供科学的参考依据。材料与方法1仪器与试药高效液相色谱仪（Agilent1260）；十万分之一天平（BS124Ssartorius），电热恒温水浴锅（HHS型上海东星建材试验设备有限公司）；超声清洗仪（KQ-100E型昆山市超声仪器有限公司）；离心机（800型4000r/min江苏正基仪器有限公司）。对照品：白茅根对照药材（中国药品生物制品检定所，121145-201003）；钩藤对照药材（中国药品生物制品检定所，121190-201204）；黄连对照药材（石家庄市第五医院制剂室提供）；盐酸小檗碱（中国药品生物制品检定所，批号为110713-201212）。试剂：甲醇、乙醚、二氯甲烷、三氯甲烷、丙酮、乙酸乙酯、丁酮、甲酸均为分析纯；乙腈（德国CNW生产公司）为色谱纯；水为纯化水。19 研究论文供试品：清热抗毒口服液（石家庄市第五医院制剂室制备，批号为140306、140307、140308，药材均由石家庄市第五医院制剂室提供）2方法2.1药品名称清热抗毒口服液为新制剂。2.2处方石膏、白茅根、钩藤、黄连等十位中药构成（因本制剂已申请专利保护，故处方不便透露。）2.3制法按处方比例称取药材，加水煎煮2次，第一次提取1小时，加10倍量水，第二次提取1小时，加8倍量水，合并煎液，滤过，滤液浓缩至相对密度为1.05-1.08的溶液，离心，加入适量的糖浆和苯甲酸钠至1000ml，搅匀，灌装，灭菌，即得。2.4性状清热抗毒口服液是合剂，应为黄棕色至棕褐色液体；味微甜。2.5薄层鉴别2.5.1白茅根的鉴别取本品30ml，加乙醚提取二次，每次20ml，超声处理10分钟，合并乙醚提取液，滤过，滤液蒸干，残渣加乙醚1ml使溶解，作为供试品溶液。另取缺白茅根的本品，按供试品溶液制备方法制成阴性对照溶液。另取白茅根对照药材1g，加乙醚20ml，超声处理10分钟，滤过，滤液蒸干，残渣加乙醚1ml使溶解，作为对照药材溶液。照薄层色谱法（附录VIB）试验，吸取上述三种溶液各10μl,分别点于同一硅胶G薄层板上,以二氯甲烷为展开剂，展开，取出，晾干，喷以10%硫酸乙醇溶液，在105℃加热至斑点显色清晰。供试品色谱中，在于对照药材色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点，阴性无干扰。故将本鉴别试验列入正文。2.5.2钩藤的鉴别取本品30ml，加甲醇30ml，超声处理30分钟，滤过，滤液蒸干，残渣加5%氢氧化钠溶液20ml使溶解，用三氯甲烷振摇提取2次，每次20ml，合并三氯甲烷提取液，蒸干，残渣加1ml甲醇使溶解，作为供试品溶液。另取缺钩藤的本品，按供试品溶液制备方法制成阴性对照溶液。20 研究论文另取钩藤对照药材1g，同法制成对照药材溶液。照薄层色谱法（中国药典2010年版一部附录VIB）试验，吸取上述三种溶液各10μl,分别点于同一硅胶GF254薄层板上，以三氯甲烷-丙酮（1:2）为展开剂，展开，取出，晾干，置紫外光灯（254nm）下检视。供试品色谱中，在与对照药材色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点，阴性无干扰。故将本鉴别试验列入正文。2.5.3黄连的鉴别取本品30ml，加甲醇30ml，超声处理30分钟，滤过，滤液蒸干，残渣加1ml甲醇使溶解，作为供试品溶液。另取缺黄连的本品，按供试品溶液制备方法制成阴性对照溶液。另取黄连对照药材0.2g，同法制得对照药材溶液。再取盐酸小檗碱对照品，加甲醇制成每1ml含0.5mg的溶液，作为对照品溶液。照薄层色谱法（中国药典2010年版一部附录VIB）试验，吸取供试品溶液、阴性对照溶液各10μl,对照药材溶液、对照品溶液各2μl，分别点于同一硅胶G薄层板上，以乙酸乙酯-丁酮-甲酸-水（5:5:1:1）为展开剂，展开，取出，晾干，置紫外光灯（365nm）下检视。供试品色谱中，在与对照药材、对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的荧光斑点，阴性无干扰。故将本鉴别试验列入正文。2.5.4蒲公英的鉴别取本品20ml，加5%甲酸的甲醇溶液20ml，摇匀，静置，沉淀，离心，取上清液，蒸干，残渣加水10ml使溶解，滤过，滤液用乙酸乙酯振摇提取2次，每次10ml，合并乙酸乙酯液，蒸干，残渣加甲醇1ml使溶解，作为供试品溶液。另取蒲公英对照药材1g，加5%甲酸的甲醇溶液20ml，超声处理20分钟，滤过，滤液蒸干，残渣加水10ml使溶解，滤过，滤液用乙酸乙酯振摇提取2次，每次10ml，合并乙酸乙酯液，蒸干，残渣加甲醇1ml使溶解，作为对照品溶液。另取咖啡酸对照品，加甲醇制成每1ml含0.5mg的溶液，作为对照品溶液。照薄层色谱法（附录VIB）试验，吸取上述三种溶液各10μl,分别点于同一硅胶G薄层板上，以乙酸丁酯-甲酸-水（7：2.5：5）的上层溶液为展开剂，展开，取出，晾干，置紫外灯（365nm）下检视。供试品色谱中，在与对照药材、对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的荧光斑点，但阴性有干扰。故本鉴别试验不列入正文。21 研究论文2.6检查应符合合剂项下有关的各项规定（《中华人民共和国药典》2010年版一部附录IJ）。2.6.1相对密度测定分别取三批样品（批号），照《中华人民共和国药典》2010年版一部附录IJ合剂项下［相对密度］及附录ⅦA相对密度测定法（比重瓶法（2）法）规定测定其相对密度。分别取洁净、干燥并精密称定重量的比重瓶，分别装满三批清热抗毒口服液供试品（温度应低于20℃）后，插入中心有毛细孔的瓶塞，用滤纸将从塞孔溢出的液体擦干，置20℃恒温水浴中，放置五分钟，随时用滤纸将瓶塞顶端溢出的液体擦干，待液体不再由塞孔溢出，迅即将比重瓶自水浴中取出，用滤纸将比重瓶的外面擦净，精密称定，减去比重瓶的重量，即得供试品的重量。将供试品倾去，洗净比重瓶，装满新沸过的冷水，照上法测得同一温度时水的重量，按公式计算供试品的相对密度，即得。2.6.2pH值测定分别取三批不同批号的供试品，各取10ml，照《中华人民共和国药典》2010年版一部进行测定。附录ⅦGpH值测定法进行测定。2.6.3装量差异分别取三批清热抗毒口服液供试品各5支，将内容物分别倒入经标化的量入式量筒内，在室温下检视，每支装量与标示装量（10ml）相比较。（少于标示装量的不得多于1支，并不得少于标示装量的95%。）2.6.4微生物限度照《中华人民共和国药典》2010年版一部附录XⅢC微生物限度检查法试验。2.7含量测定2.7.1测定成分及测定方法的选择本品为石家庄市第五医院多年临床经验方，故属于新制剂，其质量标准中未规定［含量测定］项。预试验结果表明，中药复方制剂各组分之间成分复杂，存在相互协同作用。试验结果表明以盐酸小檗碱为对照，黄连可检出盐酸小檗碱，无其22 研究论文它组分干扰。同时结合处方中君臣佐使原则与功能主治，故选定盐酸小檗碱为检测指标，采用高效液相色谱法，测定成品中盐酸小檗碱含量。2.7.2方法2.7.2.1提取方法（1）取清热抗毒口服液20ml，置具塞锥形瓶中，精密加入盐酸-甲醇（1：100）混合溶液50ml，密塞，称定重量，超声处理40min（100W，40Hz），放冷，再称定重量，用盐酸-甲醇（1：100）混合溶液补足减失的重量，摇匀，经0.45μm微孔滤膜滤过，精密量取续滤液15ml，置50ml量瓶中，加盐酸-甲醇（1：100）混合溶液稀释至刻度，即得。（2）取清热抗毒口服液20ml，置具塞锥形瓶中，精密加入盐酸-甲醇（1：100）混合溶液50ml，密塞，称定重量，加热回流1小时，放冷，再称定重量，用盐酸-甲醇（1：100）混合溶液补足减失的重量，摇匀，经0.45μm微孔滤膜滤过，精密量取续滤液15ml，置50ml量瓶中，加盐酸-甲醇（1：100）混合溶液稀释至刻度，即得。将以上两种方法制得的样品在相同色谱条件下进行测定，选择待测组分含量较多，分离效果较好，出峰时间较短，峰面积积分值较高的方法作为提取方法。2.7.2.2提取条件的优化（1）超声提取时间的考察取清热抗毒口服液每份20ml，置具塞锥形瓶中，分别精密加入盐酸-甲醇（1：100）混合溶液50ml，密塞，称定重量，依次超声20min、30min、40min、50min，放冷，再称定重量，用盐酸-甲醇（1：100）混合溶液补足减失的重量，摇匀，经0.45μm微孔滤膜滤过，精密量取续滤液15ml，置50ml量瓶中，加盐酸-甲醇（1：100）混合溶液稀释至刻度。对样品色谱图进行分析，根据色谱图中各组分的峰面积积分值的大小来确定超声时间。（2）检测波长的选择用已确定的提取方法制备供试品溶液，按照色谱条件分别在345nm、265nm、274nm和240nm下进样分析，比较各色谱图，选择检测信号和灵敏度较高的波长进行测定。2.7.3对照品及供试品溶液的制备23 研究论文（1）供试品溶液的制备取本品20ml，置具塞锥形瓶中，精密加入盐酸-甲醇（1：100）混合溶液50ml，密塞，称定重量，超声处理40min，放冷，再称定重量，用盐酸-甲醇（1：100）混合溶液补足减失的重量，摇匀，经0.45μm微孔滤膜滤过，精密量取续滤液15ml，置50ml量瓶中，加盐酸-甲醇（1：100）混合溶液稀释至刻度，即得。精密吸取10µl，注入液相色谱仪，测定，记录色谱图。（2）对照品溶液的配制精密称取盐酸小檗碱对照品5mg（0.0050g），置100ml容量瓶中，用盐酸-甲醇1：100混合溶液溶解并稀释至刻度，摇匀。制成浓度为50μg/ml的盐酸小檗碱对照品溶液。精密吸取10µl，注入液相色谱仪，测定，记录色谱图。（3）阴性溶液的制备按处方比例，称取除黄连外其余药材，按［制法］制得空白样品，并按正文中供试品溶液制备方法制得空白溶液，精密吸取10µl，注入液相色谱仪，测定，记录色谱图。2.7.4色谱条件的优选色谱柱的考察：以乙腈-0.05mol/L磷酸二氢钾溶液（25:75）为流动相条件下，考察以下色谱柱：（1）岛津C18（4.6*250mm，5μm）；(2)岛津C18（4.6*150mm，5μm）。试验结果表明以上两种色谱柱均可将盐酸小檗碱达到基线分离，其中色谱柱（2）分离度较理想，故选择色谱柱（2）进行试验。色谱条件的选择：色谱柱采用岛津C18（4.6×150mm，5μm）；按“供试品溶液的制备”项下制备溶液，检测波长为265nm；流速为1.0ml/min；柱温为30℃；进样体积为10µL；分别以乙腈-0.05mol/L磷酸二氢钾溶液（25:75）、乙腈-水（50：50）和乙腈-0.05mol/L磷酸二氢钾溶液（50：50）为流动相进行试验，比较不同流动相系统的色谱图，选择分离效果最好，检测时间较短的流动相系统，同时考察柱温及流速对分离效果的影响。2.7.5方法学考察（1）系统适用性试验在上述色谱条件下，精密吸取10µL注入液相色谱仪，测得盐酸小檗24 研究论文碱的理论塔板数，分离度（R）等；理论塔板数按盐酸小檗碱峰计算应不低于3000。（2）专属性试验按处方比例，称取除黄连外其余药材，按［制法］制得空白样品，并按正文中供试品溶液制备方法制得空白溶液，精密吸取10µl，注入液相色谱仪，测定，记录色谱图。在上述色谱条件下，将阴性供试品所得色谱图与样品色谱图进行比较分析，试验结果表明，阴性对照溶液对测定组分无干扰。（3）线性范围的考察精密量取对照品（浓度为0.05mg/ml的进样1µl、5µl、10µl，浓度为0.5mg/ml的进样3µl、5µl、10µl），分别注入液相色谱仪，按拟定的色谱条件测定，测得各浓度下的峰面积，以对照品进样量（µg）为横坐标，峰面积积分值为纵坐标，绘制标准曲线。盐酸小檗碱线性方程为Y=7E+07X+24531，R=0.99995，表明在该色谱条件下，盐酸小檗碱线性关系良好。（4）检测限试验与定量限试验取对照品溶液逐步稀释后，吸取10µl注入高效液相色谱仪，当待测组分的峰高为噪声的3倍时（S/N=3），即为最低检测限；当待测组分的峰高为噪声的10倍时（S/N=10），即为最低定量限。（5）精密度试验按2.7.3项目下方法制备供试品溶液，在上述色谱条件下，连续进样6次，每次10ul，测定盐酸小檗碱峰面积，计算RSD%值为0.13%，表明精密度良好。（6）稳定性实验按2.7.3项目下方法制备供试品溶液，在上述色谱条件下于0h、1h、3h、5h、8h分别进样，进样量为10ul，测定盐酸小檗碱峰面积，计算RSD%值为0.6%，表明供试品溶液在8小时内稳定。（7）重复性试验按2.7.3项目下方法制备6份供试品溶液，分别测得盐酸小檗碱的峰面积，并计算其含量，结果盐酸小檗碱含量的RSD%为1.8%，表明重复性良好。25 研究论文（8）加样回收率实验精密量取供试品溶液2ml（盐酸小檗碱含量为361.94ug/ml），定容至10ml，精密量取2ml，共9份，分为3组，每组3份，置10ml容量瓶中。3组之间分别按所取供试品盐酸小檗碱含量的80%、100%、120%加入对照品溶液（盐酸小檗碱浓度为900ug/ml）1.6ml、2.0ml、2.4ml体积，定容至10ml。测得盐酸小檗碱的平均回收率为101%，RSD%为1.86。（9）含量测定取3批样品，按正文［含量测定］项下方法测定，各精密吸取10µl，注入高效液相色谱仪，测定，记录色谱图。2.8石膏的含量测定石膏在处方中用量最大，主要起清热祛火，除烦止渴的作用，为处方中退热作用的主要药物。为控制处方中石膏的含量，根据《中国药典》（2010年版）中对石膏含量测定的记载，结合清热抗毒口服液为液体制剂的特点，故本文采用EDTA络合滴定法测定制剂中二水硫酸钙的含量。2.8.1供试品的制备取不同批次的供试品3支，精密吸取10ml，置30ml坩埚内，敞口置于带调压器的电炉上（1000W，120V），炭化2小时，至炭化完全（所有操作均在通风橱中进行）。将供试品炭化完全的坩埚盖上盖，至马弗炉中，700-800℃，维持6小时，至灰化完全，放冷，备用。2.8.2测定方法将坩埚内的灰白色固体物质加稀盐酸10ml，加热使溶解，将溶液转移至锥形瓶中，用纯化水洗坩埚3-4次；最后加水总量为100ml，滴加甲基红指示液1滴，滴加氢氧化钾试液至溶液显浅黄色，再继续多加5ml，加钙-1黄绿素指示剂少量，用乙二胺四醋酸二钠滴定液（0.05mol·L）滴定，至溶液的黄绿色荧光消失，并显橙色。每1ml乙二胺四醋酸二钠滴定液-1（0.05mol·L）相当于8.608mg的含水硫酸钙（CaSO4·2H2O）。26 研究论文结果1药品名称由石家庄市第五医院名中医经多年临床经验总结而成，根据功能主治与临床用药特点，命名为清热抗毒口服液。2处方石膏、白茅根、钩藤、黄连等十位中药构成（因本制剂已申请专利保护，故处方不便透露。）3制法见材料与方法项下2.3项［制法］。4性状见材料与方法项下2.4项［性状］。5鉴别白茅根的薄层鉴别图谱见Fig.1。钩藤的薄层鉴别图谱见Fig.2。黄连的薄层鉴别图谱见Fig.3。6检查应符合合剂项下有关的各项规定（《中华人民共和国药典》2010年版一部附录IJ）。6.1相对密度三批样品相对密度均大于1.05，符合规定，结果见Table1。6.2pH值三批样品pH值结果均符合规定，结果见Table2。6.3装量差异三批样品装量差异结果均符合规定，结果见Table3。6.4微生物限度检查三批样品微生物限度检查结果均符合规定，结果见Table4。7提取方法的确定通过对不同提取方法的比较，确定提取方法为：取清热抗毒口服液20ml，置具塞锥形瓶中，精密加入盐酸-甲醇（1：100）混合溶液50ml，密塞，称定重量，超声处理40min，放冷，再称定重量，用盐酸-甲醇（1：27 研究论文100）混合溶液补足减失的重量，摇匀，经0.45μm微孔滤膜滤过，精密量取续滤液15ml，置50ml量瓶中，加盐酸-甲醇（1：100）混合溶液稀释至刻度，即得。8色谱条件的确立色谱条件：色谱柱为岛津C18（4.6×150mm，5μm）；以乙腈-0.05mol/L磷酸二氢钾溶液（25:75）为流动相；检测波长为265nm；流速为1.0ml/min；柱温为30℃；进样体积为10µL。9方法学考察研究9.1系统适应性试验在上述色谱条件下，盐酸小檗碱峰形良好，与各相邻色谱峰分离度均大于1.5，理论塔板数按盐酸小檗碱峰计算应不低于3000。9.2专属性试验按处方比例，称取除黄连外其余药材，按［制法］制得空白样品，并按正文中供试品溶液制备方法制得空白溶液，精密吸取10µl，注入液相色谱仪，测定，记录色谱图。在上述色谱条件下，将阴性供试品所得色谱图与样品色谱图进行比较分析，试验结果表明，阴性对照溶液对测定组分无干扰。9.3线性关系考察以对照品进样量（µg）为横坐标（X），峰面积积分值为纵坐标（Y），绘制标准曲线。计算盐酸小檗碱回归方程为Y=7E+07X+24531，R=0.99995。表明在该色谱条件下，盐酸小檗碱在0.05-5µg/ml范围内呈良好的线性关系。结果见Table5及Fig.4。9.4最低检测限与最低定量限取对照品溶液逐步稀释，吸取10µl注入高效液相色谱仪，以待测组分的峰高为噪声的3倍时（S/N=3）计，盐酸小檗碱最低检测限为0.025µg/ml；以待测组分的峰高为噪声的10倍时（S/N=10）计，盐酸小檗碱最低定量限为0.05µg/ml。9.5精密度试验在上述色谱条件下，连续进样6次，每次10ul，测定盐酸小檗碱峰面积，计算RSD%值为0.13%，结果表明仪器和色谱条件的精密度良好。结果见Table6。28 研究论文9.6稳定性试验在上述色谱条件下，取供试品溶液于0h、1h、3h、5h、8h分别进样，进样量为10ul，测定盐酸小檗碱峰面积，计算RSD%值为0.6%，结果表明供试品溶液在8小时内稳定。结果见Table7。9.7重复性试验取同一批供试品溶液6份，分别测得盐酸小檗碱的峰面积，并计算其含量，结果盐酸小檗碱含量的RSD%为1.8%，结果表明本方法重复性良好。结果见Table8。9.8加样回收率试验量取已知含量的供试品溶液9份，分为3组，每组3份，3组之间分别按所取供试品盐酸小檗碱含量的80%、100%、120%加入对照品溶液，分别测得峰面积并计算含量，结果计算平均回收率为101%，RSD%为1.86。盐酸小檗碱的加样回收率在95%～105%之间，结果表明加样回收良好，结果见Table9。9.9含量测定取3批样品，按正文［含量测定］项下方法测定盐酸小檗碱峰面积，并计算平均含量和RSD值。结果见Table10及Fig.5、Fig.6、Fig.7。10石膏的含量测定根据《中国药典》（2010年版）中对石膏含量测定的记载，结合清热抗毒口服液为液体制剂的特点，采用EDTA络合滴定法测定制剂中二水硫酸钙的含量。结果见Table11。29 研究论文附图123451，2，5thesample；3referencesubstances；4negativesampleFig.1ThinlayerchromatographyofRhizomaimperatae123451，2，4thesample；3referencesubstances；5negativesample30 研究论文Fig.2ThinlayerchromatographyofUncaria123451referencesubstances；2，5thesample；3Berberinehydrochloridereferencesubstances；4negativesampleFig.3ThinlayerchromatographyofCoptischinensis400000000y=7E+07x+245313500000002R=0.9999300000000250000000系列1200000000线性(系列1)1500000001000000005000000000123456Fig.4Referencesubstancesstandardcurveofberberinehydrochloride31 研究论文500500450450400400350350300300250250mAUmAU20020015015010010050500001234567891011121314151617181920分钟Fig.5HPLCchromatogramofQingrekangduoralliquid500500450450400400350350300300250250mAUmAU20020015015010010050500001234567891011121314151617181920分钟Fig.6HPLCchromatogramofberberinehydrochloride32 研究论文500500450450400400350350300300250250mAUmAU20020015015010010050500001234567891011121314151617181920分钟Fig.7HPLCchromatogramofQingrekangduoralliquidnegativesample33 研究论文附表Table1ResultsofRelativedensityBatchnumberRelativedensity1403061.081403071.081403081.08Table2ResultsofpHvalueBatchnumberPH1403064.951403074.931403084.94Table3ResultsofLoaddifferenceBatchnumberLoaddifference140306符合规定140307符合规定140308符合规定Table4ResultsofMicrobiallimittestBacteriaMold,yeastEscherichiacoliBatchnumber（cfu/ml）（cfu/ml）（cfu/ml）140306＜100＜100未检出140307＜100＜100未检出140308＜100＜100未检出34 研究论文Table5ResultsofdeterminationofStandardcurveNumber123456Samplevolume0.050.250.51.52.55（µg）Peakarea（A）34484341859027237710889107384295181302143363995547Table6ResultsofPrecisiontestAveragevalueNumberPeakareaRSD%(Peakarea)1160396421604225316056741602945.50.13%416029145160051761600379Table7ResultspercentofStabilitytestAveragevalueTime(h)PeakareaRSD%(Peakarea)02738024012736153932717404027231268.60.6%52700907582723144935 研究论文Table8ResultspercentofRepeattestContentNumberPeakareaAveragevalueRSD%（mg/ml）1273802400.3642263354890.3503274303860.3640.3621.8%4271011270.3605277047900.3686275302350.366Table9ResultspercentofRecoverytestContentSamplingAddingMeasuredRateofAverageoftheRSDNumberquantityamountquantityrecoveryrecoverysamples（%）（ml）（mg）（mg）（%）rate（%）（mg）120.1460.1160.270103.21220.1450.1160.264101.13320.1450.1160.261100.14420.1440.1450.296102.38520.1460.1450.295101.521011.86620.1450.1450.296102.16720.1450.1740.31799.43820.1430.1740.31398.62920.1460.1740.31999.6936 研究论文Table10Resultsofcontentdetermination（n=3）BatchnumberSamplingContentoftheContentAveragevalueRSDquantity（ml）samples(mg/10ml)（mg/10ml）（%）(mg/ml)140306200.3623.62200.3583.58140307200.3603.603.612.65200.3653.65140308200.3633.63200.3593.59Table11Resultsofcontentdeterminationofgypsum（n=3）BatchnumberSamplingEDTACaSO4·2H2OAveragevalueRSDquantity（ml）(ml)(mg)（mg/10ml）（%）140306107.161.12107.060.26140307106.858.5360.41.27106.959.40140308107.161.12107.261.9837 研究论文讨论1测定成分及测定方法的选择本品为石家庄市第五医院多年临床经验方，故属于新制剂，其质量标准中未规定［含量测定］项。中药复方制剂各组分之间成分复杂，存在相互协同作用。试验结果表明以盐酸小檗碱为对照，黄连可检出盐酸小檗碱，无其它组分干扰。同时结合处方中君臣佐使原则与功能主治，故选定盐酸小檗碱为检测指标，采用高效液相色谱法，测定成品中盐酸小檗碱含量。2提取方法的确立结合盐酸小檗碱特性，本试验选用超声提取和回流提取两种不同的提取方法进行比较，试验结果表明，采用超声处理盐酸小檗碱的提取效果较好，样品含量相差不大，但超声处理操作简单，用时较短，故选择超声方法提取。3超声时间的选择通过对不同超声时间的样品色谱图进行分析，超声时间为40min与50min的样品色谱峰差别不大，考虑到节约能源的因素，所以选择40min为最佳时间。4检测波长的选择用已确定的提取方法制备供试品溶液，按照色谱条件分别在345nm、265nm、274nm和240nm下进样分析测定，结果表明用265nm检测时基线稳定，待测组分峰形对称，分离度好，检测信号和灵敏度较高，故选择265nm为检测波长。5色谱条件的选择色谱柱采用岛津C18（4.6×150mm，5μm）；按“供试品溶液的制备”项下制备溶液，检测波长为265nm；流速为1.0ml/min；柱温为30℃；进样体积为10µL；本试验分别以乙腈-0.05mol/L磷酸二氢钾溶液（25:75）、乙腈-水（50：50）和乙腈-0.05mol/L磷酸二氢钾溶液（50：50）为流动相进行试验，比较不同流动相系统的色谱图，结果表明以乙腈-0.05mol/L磷酸二氢钾溶液（25:75）为流动相时，不仅分离效果好，灵敏度较高，而且缩短了待测组分的保留时间，所以选择乙腈-0.05mol/L磷酸二氢钾溶38 研究论文液（25:75）为本试验的流动相系统。6石膏含量测定方法本制剂中石膏的用量最大，为君药，故石膏的含量测定可作为清热抗毒口服液质量标准的定量指标之一。根据《中国药典》（2010年版）中对石膏含量测定的记载，而清热抗毒口服液为黄棕色至棕褐色液体，若直接滴定颜色有干扰，无法确定终点。为控制处方中石膏的含量，结合液体制剂的特点，故本课题采用EDTA络合滴定法测定制剂中二水硫酸钙的含量。即先将液体制剂炭化、灰化完全后，再进行滴定。灰化后的灰白色粉末在加入稀盐酸加热溶解后，为无色透明溶液，不影响滴定终点的判断。此方法操作性强，简单易行，可作为清热抗毒口服液中石膏的含量测定方法。7盐酸小檗碱含量测定的选择本制剂中除君药石膏用量大外，黄连为成方中臣药的重要组成部分，而黄连中盐酸小檗碱有清热润燥、泻火解毒的功效，为本制剂中主要药效成分之一。故选择盐酸小檗碱的含量作为本制剂质量控制的定量指标之一。8质量标准的建立本试验为清热抗毒口服液质量标准建立的初步研究，对质量控制的指标进行了方法学研究，为其质量标准的建立提供了基础的科学依据。质量标准中含量限度的确定有待进一步研究。小结本文采用TLC法建立了清热抗毒口服液中白茅根、钩藤、黄连等主要药材的鉴别方法，作为该制剂质量标准中定性分析的指标。高效液相色谱法具有分离效能高、专属性强、灵敏度高、分析速度快等优点。本试验建立了采用高效液相色谱法测定清热抗毒口服液中盐酸小檗碱含量的方法，同时采用EDTA法测定该制剂中石膏的含量。盐酸小檗碱与石膏的含量测定，作为该制剂质量标准中定量分析的指标。本方法操作简便，可行性强，结果准确可靠，试验成本低，可以有效的控制清热抗毒口服液的质量，为保证清热抗毒口服液的质量提供了科学、规范的控制方法。39 研究论文参考文献1中华人民共和国药典委员会.《中国药典》(2010年版,一部)[M].北京:中医药科技出版社,20102黄玲,王明霞.高效液相色谱法测定香连片中盐酸小檗碱的含量[J].中国现代药物应用,2010,4(13):15-163程力惠,周晔.蓝芩口服液定性定量方法的研究.中南医药,2011(9):680-6834王翠云,杜辉.抗病毒口服液的质量标准研究.黑龙江科技信息,2014,27:355李晓明,邵爱娟等.小儿清热止咳口服液中石膏的含量测定.中国实验方剂学杂志,2011,17(19):72-73结论清热抗毒口服液通过引入加权综合评分法和正交设计优选出较好的制备工艺流程，使生产过程简单，可操作性强。通过处方药材提取工艺的优化确定了清热抗毒口服液的制备工艺流程。经过试验研究，建立了清热抗毒口服液的质量标准体系，此质量标准体系的建立为有效的控制清热抗毒口服液的质量提供依据。以盐酸小檗碱和石膏的含量作为质量控制指标，质量控制方法和含量测定方法操作简单，可行性强，灵敏度高，精密度好。通过试验研究建立的质量标准方法可靠、客观、合理，使该制剂有更好的质量保证，以便更好的为临床应用服务。40 综述综述手足口病治疗方法、预防及治疗药物质量控制方法研究进展手足口病是由肠道病毒引起的传染病，多发生于5岁以下儿童，可引起手、足、口腔等部位的疱疹，少数患儿可引起心肌炎、肺水肿、无菌性脑膜脑炎等并发症。手足口病对个别重症患儿病情发展很快并导致死亡。引发手足口病的肠道病毒有20多种，其中以柯萨奇病毒A16型（CoxA16）和肠道病毒71型（EV71）最为常见，并于1958年与1969年先后被分离［1］出来，并且于1972年在美国被首次确认其可导致手足口病。1994年英国爆发一起由CoxA16引起的波及英格兰、威尔士地区的手足口病，共发［2］现952个病例。20世纪90年代后在美国、保加利亚、匈牙利等国家先［3］后流行。我国台湾地区1998年发生了1.3万例手足口病，死亡74例；大陆自1981年在上海始见此病后，北京、天津、河北等地先后报道了手［4-6］足口病。自2008年以来，亚洲已有五个国家报告有EV71病毒引起的［7］手足口病。目前，手足口病已成为危害5岁以下儿童身体健康的重要传染病之一。近年来，手足口病在中国的发病率显著升高，逐渐引起人们关注。1发病机制［8］手足口病的发病机制尚不明确，越来越多研究显示手足口病患儿存在免疫功能调节障碍，始动因子（病毒感染）引起免疫紊乱，促炎细胞因子/抗炎细胞因子异常分泌，进而引起炎症反应，激发全身炎症反应综合征和脓毒症，参与了疾病的发生，同时机体免疫功能状态可能对手足口病的病情转归发挥重要作用。手足口病患儿体内T淋巴细胞亚群、细胞因子、免疫球蛋白及补体水平均存在异常，它们随着疾病进展呈现动态变化。T细胞在免疫发病机制中起介导作用，不同的T细胞亚群在肠道病毒感染后发挥各自作用，它们共同调控免疫球蛋白的合成，从而控制细胞因子的产生和释放。对手足口病免疫学发病机制的认识，为临床治疗提供科学的理论依据，有助于寻求新的治疗靶点，以治疗性疫苗、细胞因子等为基础的免疫治疗有待进一步研究，也通过免疫学调控给手足口病的治疗带41 综述来了新的希望。手足口病在中医古籍中虽未有记载此病名，但根据发病特点，传统中［9］医理论对此病的病因确有独到的见解。中医学认为，手足口病症属于中医“时疫”、“风温”、“湿温”等范畴，其病因为感受疫毒时邪，病位主要在脾、肺、心三脏。小儿脾常不足，肺脏娇嫩，易受损伤。疫毒时邪由口鼻而入，内侵肺脾，卫表被遏，肺气失宣，则见发热、头痛、咳嗽、流涕等；邪毒循经，熏蒸口舌，则口腔疱疹、口痛、拒食、流涎，邪热熏蒸四肢，则手足疱疹；若毒热内盛，气营两燔，则四肢臀部疱疹分布稠密，全身症状重；若邪毒逆传心包，内陷厥阴，可出现壮热、神昏、抽搐等危象。2治疗方法2.1中医治疗［10］中医治疗手足口病大致可以分为前驱期、发疹期及恢复期三个阶段,治疗时根据患者不同的临床症候进行辨证分型，拟定处方并随症加减。前驱期患者主要症状为发热、咳嗽、微恶风、鼻塞流涕，甚至纳差、泄泻、恶心、呕吐等症状，舌苔薄白，脉浮数，以清凉解表,疏散风热，[11]宜选用银翘散加减治疗。马爱军方用：连翘9g、金银花9g、牛蒡子9g、桔梗9g、荆芥穗9g、薄荷9g、竹叶4g、生甘草6g、淡豆豉6g。治疗患者30例中，用药3剂，其中治愈14例，好转16例，疗效较为满意。对于同时伴有少量疱疹的患者，还可以采用托疹透毒外出的方法进行治疗,使邪有所出，热毒得泄，疾病得愈。发疹期主要症状为口痛拒食,手、足、口、咽部出现大量疱疹,局部瘙痒，同时伴有发热、烦躁不安、尿黄赤,大便便溏或干结，舌红、苔[12]多黄腻，脉滑数。治疗以清热解毒祛湿为主，或兼以透疹外出。钱焕洋用解毒透疹汤治疗手足口病54例,发热咽痛者加柴胡、桔梗；便秘者加生大黄；津伤明显者加天花粉、玄参。1周内治愈46例，8例因局部感[13]染严重，于8～12天内治愈，疗效显著。张同园自拟蓝根解毒汤治疗手足口病患者30例，治愈26例，好转4例，能明显缩短病程，疗效确切。对于湿重于热者，临床症状除见大量疱疹显现,疱中含有脓液外,还伴有大便稀溏，苔黄腻，脉滑。治疗应以化湿为重点,兼以清热解毒。刘[14]敏采用经方葛根芩连汤治疗44例手足口病患儿，大便干结加生大黄；发热无汗加青蒿、荆芥；高热持续不退加石膏、羚羊角、水牛角。治疗组42 综述治愈37例，好转5例，总有效率为95.5%。恢复期患者以阴伤脾虚为主，疱疹渐消，伴有身热渐退、口渴、舌红[15]少津、脉细数，治疗宜健脾助运，生津养阴为主。李向东使用陈皮、厚朴、苍术各6g、砂仁(后下)2g、神曲6g、麦门冬9g、芦根9g。每日1剂，水煎2次，取汁100ml，早晚分服，疗效满意。［16］用于治疗手足口病的中成药可分为口服制剂和注射液两类，普通型患者多以清热为主的口服制剂，重型和危重型患者则需用具有解毒和回阳功效的注射剂。这些中成药制剂的功能辨证特征以化解湿热为主、兼顾清热解毒。[17]金莲清热泡腾片主要含有石膏、金莲花、大青叶、苦杏仁和地黄等，其中大青叶、金莲花等为主要组分，主要以清热解毒为主，另有止咳祛痰[18]之功效。经体外药理学试验显示，金莲清热泡腾片对柯萨奇病毒A组[19]16型和肠道病毒71型均有一定的抑制活性。临床研究证实，金莲清热泡腾片治疗手足口病的疗效确切，治疗普通型手足口病疗效显著，特别是对于手足口病普通型邪犯脾肺证的疗效肯定。此外，金莲清热泡腾片还具有抗其他病毒的作用，对以病毒为主要致病原的疱疹性口腔炎和咽峡炎等也有明显的治疗作用。蓝芩口服液主要有清热解毒、利咽消肿之功效。临床上主要用于急性咽炎以及实热所致各种病症。选取肺炎球菌、金黄色葡萄球菌、甲型溶血[20]链球菌等7种常见感染致病菌进行体外连续稀释抑菌试验，结果表明蓝芩口服液在不同稀释浓度下对这些细菌均有显著的抑制作用。研究显示[21]，在退热、补充水分等多种对症治疗的基础上，对儿童手足口病患者再给予蓝芩口服液治疗，他们的退热、疱疹和皮疹消退的平均时间，与单用利巴韦林治疗相比有一定程度的减少。抗病毒口服液含有绿原酸、黄芩苷、连翘酚和大黄蒽醌等具有清热解[22]毒、凉血祛湿等功效的化学成分，对风热病症尤其有效。体外试验证明，抗病毒口服液能明显降低由细菌内毒素引起的发热家兔的体温，并有效地[23]抑制动物病毒性肺部感染模型的病理进展。董巧丽等的研究显示，抗病毒口服液治疗手足口病的疗效显著，联合使用抗病毒口服液和利巴韦林喷雾剂治疗患者的退热、口腔疱疹消退和四肢疱疹消退时间均较单用利巴韦林组显著减少，并且有病程缩短的趋势。许多研究表明，抗病毒口服液可43 综述以明显提高部分单用药物的疗效，这可能与中成药能够提高免疫力、间接增强机体的抗病毒能力有关。2.2中西医结合治疗目前国内外尚无预防用药以及西药特效抗肠道病毒药物，主要是对症[24]处理和脏器支持治疗。戴蔷蕾，李晶等采用干扰素联合炎琥宁法治疗小儿手足口病进行临床研究，结果表明联合用药组与单一用药组在用药后临床表现及临床效果方面比较，具有统计学意义（P<0.05），效果更好。黄[25]少萍采用炎琥宁注射液联合利巴韦林治疗儿童手足口病的研究表明，在退热、皮疹消退及痊愈时间等方面联合治疗有较好的临床疗效。胡华著等[26]应用米力农在重症手足口病的临床研究显示，早期应用米力农治疗重症手足口病能明显改善心肺功能,减少神经源性肺水肿及呼吸循环衰竭的发生率，改善预后及缩短治疗时间。[27][28]除此之外，热毒宁、喜炎平以及小剂量激素短程治疗均对普通手足口病有明显的临床疗效。2.3外用治疗[29]倪振华在内服药治疗的基础上,辅助以局部外治,在78例患者中对其中63例采用局部外治法。其中26例患者仅用西瓜霜合并冰硼散吹敷口腔患处；另外37例除口腔用药外,对手足疱疹则用金黄散或青黛散均[30]匀撒布患处，对治疗亦有一定的辅助作用。宋阿冬采用舌疮散治疗口咽峡部的疱疹。方药组成：生石膏10g、青黛3g、冰片1g、生蒲黄1g。以上药共同研细末,先取金银花20g、甘草10g，加开水100ml浸泡,待冷却后可含漱口腔或用消毒棉签蘸此水清洗患处，而后将以上药末涂抹于患处，每日3～4次，经治疗后患者的口腔疱疹明显好转，能进饮食。[31]此外，一项对157例手足口患儿研究表明，与应用布洛芬相比，应用中药熏洗疗法治疗手足口病的治疗过程更安全、治疗效果更好。同时，中药熏洗疗法可以通过热力与药力相结合的方式直达病灶，从而减少内服及注射解热镇痛药对患儿肝肾功能的损害，降低了患儿病情向重症转化的风险。[32]樊小阳采用利巴韦林注射液外涂手足口病患儿，患儿皮疹消退时间缩短,方法简单、显效快,无不良反应,是临床治疗手足口病安全可靠的选择。44 综述[33]张小丹等采用重组人干扰素α-2b注射液雾化吸入治疗儿童手足口病的临床研究表明，重组人干扰素α-2b注射液雾化吸入对于促进手足口病患儿体温恢复及疱疹愈合方面的临床疗效满意,且安全性好,值得临床进一步研究推广。[34]研究表明，针对重症手足口患儿，在常规治疗基础上给予高渗盐水治疗可以明显提高治疗效果，提高患儿钠离子浓度，从而改善预后，具有十分重要的临床意义。3药物的质量控制方法中医理论认为，手足口病多因外感湿热疫毒而起，故治疗一般以清热解毒，化湿凉血为主。常用药物有金银花、连翘、黄芩、竹叶、生石膏、板蓝根、黄连、栀子、藿香、灯心草等。常用的中成药口服制剂有金莲清热泡腾片、蓝芩口服液、抗病毒口服液等；注射剂有热毒宁注射液、炎琥宁注射液等。3.1中药材的质量控制高效液相色谱法是对药材含量进行定量分析的常用方法，在药典中收［35］载的中药材几乎都是采用HPLC作为药材含量的质量控制标准。肖平等采用高效液相色谱法测定板蓝根药材中(R，S)-告依春的含量。该方法采用HanbonHederaC18色谱柱(4.6mm×250mm,5μm)，流动相为乙腈(A)-水(B)，线性梯度洗脱，流速为1.0mL·min-1，检测波长为254nm，柱温30℃。试验结果表明(R，S)-告依春的线性范围为0.72~28.80mg/L(r=0.9998)，平均回收率为99.33%(RSD=0.94%)。该方法简便、灵敏度高、结果准确可靠，可作为板蓝根质量控制的有效方法。3.2中成药口服制剂［36］许秀娟等采用HPLC建立金莲清热泡腾片中靛玉红的含量测定方法。色谱柱为安捷伦Eclipse-XDB-C18柱(250mm×4.6mm，5μm)，流动相为甲醇-水(75∶25)，流速为1.0mL.min-1，检测波长为289nm，柱温为35℃。试验结果表明靛玉红在2.07～41.44ng范围内呈良好线性关系(r=1)，平均回收率为98.3%，RSD为0.8%(n=6)。此方法准确可靠，科学合理，可作为金莲花清热泡腾片的质量控制方法。［37］程力惠等利用薄层色谱法对蓝芩口服液中的板蓝根、栀子、黄柏、胖大海进行鉴别研究。采用高效液相色谱法测定蓝芩口服液中黄芩苷的含45 综述量。结果表明黄芩苷在0.21～5.13μg与峰面积呈良好线性关系，r=0.9998，平均回收率97.4%，RSD为1.9%(n=6)，蓝芩口服液中黄芩苷的含量为18.439～20.456mg/支。该方法精密度良好、数据准确，可用于蓝芩口服液的质量控制。［38］王翠云等采用薄层色谱法对抗病毒口服液中的金银花、板蓝根、大黄等药材进行定性鉴别，并且采用HPLC对制剂中的黄芩苷进行了含量测定。测得黄芩苷的回归方程为Y=67623.6X-9687.3，r=0.9998。结果表明黄芩苷在0.038-1.42μg的浓度范围内线性关系良好，平均回收率为99.7%，RSD为1.5%。该实验所用方法简便、快速、准确，并能够有效地为抗病毒口服液的质量控制方法提供依据。3.3中成药注射剂热毒宁注射液为复方中草药注射剂，由金银花、栀子、青蒿三味中药［39］组成，具有抗炎、抗病毒、解热作用，对多种病毒均有抑制作用。萧伟等采用毛细管气相色谱法与氢火焰检测器及质谱对热毒宁注射液进行检测分析。通过建立热毒宁注射液GC指纹图谱，测定热毒宁注射液挥发性成分，并说明了其药材归属。该方法准确、精密度好，为热毒宁注射液挥［40］发性成分的质量控制提供了依据。毕宇安等采用高效液相色谱法建立热毒宁注射液HPLC-UV指纹图谱含量测定以及多指标成分的含量测定方法，色谱柱为PhenomenexC18(4.6mm×250mm，5μm)，流动相为甲醇-磷酸水溶液，梯度洗脱，指纹图谱检测波长为225nm，多指标成分含量测定的检测波长为324nm，237nm。结果表明：在相同色谱条件下，采用不同的检测波长进行指纹图谱的测定，并对多指标成分(绿原酸、栀子苷、咖啡酸等9个成分)进行含量测定。从指纹图谱中有14个共有峰得到确定，10批该注射液的指纹图谱的平均相似度达到0.95以上。结果显示：此10批热毒宁注射液中9个成分的含量均一、稳定。通过系统的方法学验证，此方法能够快捷、准确的测定出热毒宁注射液的指纹图谱及其多成分含量。该方法分别从定性定量的角度全面的反映热毒宁注射液中的主要成分及其变化情况，从而提高了热毒宁注射液内在质量控制水平。［41］王雪等采用体积排阻色谱法建立热毒宁注射液中高分子物质的测定方法。色谱柱为TSKG2000SWxl凝胶色谱柱（300mm×7.8mm，5μm），流动相为乙腈-0.1%三氟乙酸水溶液（30∶70），体积流量为0.7mL/min，46 综述检测波长为214nm，柱温为30℃。结果表明：相对分子质量在3108～66446的物质，其相对分子质量对数与保留时间的线性关系良好（r＝0.9920）。试验的11批热毒宁注射液均未检出高分子物质。该方法简便易行，结果准确可靠，可作为评价热毒宁注射液质量内控方法。［42］蔡沫等用高效液相色谱法测定注射用炎琥宁的含量。色谱柱选择COSMOSIL5C18-MS-ⅡWaters（4.6×250mm），流动相为磷酸盐缓冲液（取磷酸二氢钾2.72g，加水溶解并稀释至1000ml，用磷酸调PH至3.0±0.05，摇匀，即得）-乙腈（55:45），流速为1.0ml/min，检测波长为251nm，柱温为室温。试验结果显示：注射用炎琥宁的线性范围为20-600μg/ml，r=0.9994，回收率为99.02%，RSD为0.7%。该方法快［43］速、准确，故可用于注射用炎琥宁的质量控制。徐莉采用HPLC法对炎琥宁原料及其制剂的含量进行测定。该试验采用WatersXTerraRRP18(150nm×4.6mm，5μm)，流动相为0.05%磷酸二氢钾(用磷酸调pH至2.5±0.05)-甲醇(3∶7)，检测波长为251nm。结果表明：脱水穿心莲内酯琥珀酸半酯在0.02～1.0mgmL-1范围内呈良好的线性关系；回归方程：A=7415C+1098(r=0.9999)，平均回收率为100.41%，RSD：0.79%(n=9)。该方法简便、灵敏度高、可作为炎琥宁原料及其制剂的质量控制标准。4预防手足口病患者和隐性感染者均为本病的传染源。病毒主要经粪-口途径、呼吸道飞沫途径传播，亦可经接触病人皮肤、粘膜泡疹液而感染。病人粪便、疱疹液和呼吸道分泌物及其污染的手、毛巾、手绢、牙杯、玩具、食具、奶具、床上用品、内衣以及医疗器具等均可造成本病传播。手足口病传播途径多，婴幼儿和儿童属于易感人群。普及预防知识是最有效措施。［44］预防手足口病的十五字口诀是：洗净手、喝开水、吃熟食、勤通风、晒衣被。做好儿童个人、家庭和托幼机构的卫生是预防本病传染的关键。针对这种现状,更加凸显出中医药辨证治疗灵活性、有效性和针对性的优势，继承和发扬中医药治疗的优势和特色对于提高手足口病的临床疗效至关重要。47 综述参考文献1蒋心华,潘孝彰等.现代感染病学[M],上海:上海医科大学出版社,1998642-6562傅希贤,新型肠道病毒感染[M]∥李梦东,王宇明.实用传染病学.3版北京:人民卫生出版社,2004:441-4433沙爱龙,刘影.手足口病的研究概况[J].生命科学仪器,2007,5(11):13-154刘灿兰,赵琳娜,秦元安.手足口病及医院感染控制[M].中国感染控制志,2005,4(4):331-3355史建国,吴春燕.一起手足口病爆发的流行病学调查[J].现代预防医学2005,13(11):14986于雪静,闫静,王皓.93例手足口病流行病学调查与临床分析[J].中国热带医学,2007,7(3):369-3737孟庆普.公众关注手足口病防控进展[N].健康报,2008-5-4(1)8吕圆圆.蚌埠医学院,手足口病免疫学发病机制及临床诊疗进展9王有鹏,李志军等.小儿手足口病中医分型论治初探.中国中西医结合儿科学,2009,1(4):366-36710殷子斐,苏永华,胡玉芝.手足口病的中医治疗.中医儿杂志,2008,4(1):51-5411韩志敏.金莲清热泡腾片治疗手足口病(普通型)临床研究[D].成都:成都中医药大学,2012:46-4812钱焕祥.解毒透疹汤治疗手足口病54例[J].江西中医药,2000,31(6):3313张同园.自拟蓝根解毒汤治疗小儿手足口病[J].天津中医,1999,16(6):1614刘敏.葛根芩连汤加味治疗小儿手足口病临床观察[J].广西中医学院学报,2006,9(1):27-2815李向东.清热祛湿运脾养阴法治疗手足口病50例[J].河北中医,2005,27(10):76116孟现民,申理等.治疗手足口病的常用口服中成药制剂.上海医药,2014,3(35):15-1717许秀娟,谢秉湘,李志梅.高效液相色谱法测定金莲清热泡腾片中靛玉红的含量[J].海峡药学,2011,23(2):234-23848 综述18林秋凤,冯顺卿,李药兰,等.金莲花抑菌抗病毒活性成分的初步研究[J].浙江大学学报(理学版),2004,31(4):412-41419韩志敏.金莲清热泡腾片治疗手足口病(普通型)临床研究[D].成都:成都中医药大学,2012:46-4820许兴全.蓝芩口服液的体外抑菌作用[J].现代医药卫生,2007,23(3):42321孙冰,韩云坤,张新朝.蓝芩口服液治疗手足口病普通患儿的疗效观察[J].当代医学,2012,18(14):139-14122张建民,庹玉玲,关晶.抗病毒口服液的抗病毒作用实验研究[J].北京医学,2008,30(7):445-44623董巧丽,柏金秀,杨小巍.抗病毒口服液治疗手足口病普通病例的疗效观察[J].儿科药学杂志,2012,18(6):27-2924戴蔷蕾,李晶.干扰素联合炎琥宁治疗小儿手足口病的临床效果观察[J].当代医学,2011,1(2):126-12725黄少萍.炎琥宁注射液联合利巴韦林治疗儿童手足口病的临床分析[J].内科,2010,6(12):38-3926胡华著等.应用米力农在重症手足口病的临床研究[J].中国现代医学杂志,2014,5(11):168-16927董巧丽,柏金秀等.喜炎平注射液和热毒宁注射液治疗手足口病普通病例的疗效观察[J].临床和实验医学杂志,2012,9(8):113-11428石卫东.小剂量激素短程治疗手足口病的疗效观察.大家健康,2014,18(3):98-9929倪振华.辨证治疗小儿手足口病78例[J].江苏中医,1998,19(11):29-3030宋阿冬.舌疮散配清开灵治疗手足口病72例[J].河北中西医结合杂志,1998,7(7):106731唐广强.用中药熏洗疗法治疗手足口病的退热效果观察[J].当代医药论丛,2014,12(11):294-29532樊小阳.利巴韦林注射液外用治疗手足口病皮疹疗效观察[J].中国社区医师,2014,10(21):67-6833张小丹等.采用重组人干扰素α-2b注射液雾化吸入治疗儿童手足口病的疗效观察[J].现代药物与临床,2014,4(16):82-8334陈建欣,谢城.高渗盐水对危重症手足口病患儿的治疗作用[J].现代医49 综述院,2014,8(15):63-6435肖平,陈建伟等.高效液相色谱法同时测定板蓝根药材中5种成分的含量.医药导报,2014,33(11):1482-148636许秀娟,谢秉湘,李志梅.高效液相色谱法测定金莲清热泡腾片中靛玉红的含量.海峡药学,2011,23(2):39-4037程力惠,周晔.蓝芩口服液定性定量方法的研究.中南医药,2011,9(9):680-68338王翠云,杜辉.抗病毒口服液的质量标准研究.科技论坛:3539萧伟,凌娅等.热毒宁注射液的GC/MS指纹图谱.中国天然药物.2007,5(2):127-12940毕宇安等.热毒宁注射液高效液相色谱指纹图谱研究及多成分定量分析.中医药现代化,2010,12(2):298-30241王雪,李家春.体积排阻色谱法测定热毒宁注射液中高分子物质.中草药,2013,44(11):1412-141542蔡沫,崔宏冰.高效液相色谱法测定注射用炎琥宁.医药与保健:17743徐莉.HPLC测定炎琥宁的原料及其制剂的含量.药学与临床研究,2007,15(1):83-8544王敏,王捷等.手足口病的研究现状[J].华北国防医药,2008,20(5):85-8650 致谢致谢时间过得真快，转眼间研究生学习生活即将划上圆满的句号。我由衷的感谢在求学期间给与我帮助和关心的人。首先由衷的感谢我的导师查建蓬教授，他渊博的知识、敏捷开阔的思维、严谨的治学态度、诲人不倦的无私胸襟、包容的心态使我受益无穷，都是值得我学习与效仿的。从课题设计、到实施，再到论文的撰写，无不渗透着导师的心血。在此由衷的感谢查老师的悉心培养与谆谆教诲。感谢同事胡玮佳、王彩虹和白洁在课题研究期间给予的大力支持与帮助。感谢河北医科大学研究生学院的各位老师给予的支持与细致的工作。在此一并致以最诚挚的谢意！51 个人简历个人简历一、一般情况姓名杨静性别女民族汉族出生日期1981年01月15日籍贯河北灵寿二、个人经历2003年06月毕业于河北科技大学制药工程专业。2003年12月石家庄市第五医院工作至今。2006年评为石家庄市第五医院2006年度先进个人2010年评为石家庄市第五医院2010年度先进个人52