蓖麻毒素对小鼠巨噬细胞系raw 264.7细胞自噬作用研究

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1、中文摘要蓖麻毒素对小鼠巨噬细胞系Raw264.7细胞自噬作用研究蓖麻毒素(RT)是天然毒素中毒性较强的毒素之一，具有很强的细胞毒性。由于所用剂量不同，作用有所不同。高剂量RT可抑制蛋白质合成，低剂量RT可诱导细胞因子的产生、脂质过氧化损伤，诱导细胞凋亡。近年来，RT被广泛用于抗癌免疫毒素的研究及生物杀虫剂。自噬广泛存在于真核生物中，在细胞生长发育、细胞分化等过程中起着重要的作用，可以维持细胞自身的动态平衡。当机体处于营养缺失，氧化应激等刺激下，机体自噬水平会上调。但RT作用Raw264.7细胞后，是否对细胞自噬有作用目

2、前尚不清楚。实验目的：本实验以小鼠巨噬细胞系Raw264.7细胞为研究对象，探讨RT对小鼠巨噬细胞系Raw264.7细胞自噬的作用。实验方法：(1)检测RT对小鼠巨噬细胞系Raw264.7细胞自噬的作用MTT方法检测Raw264.7细胞存活率；免疫荧光方法检测LC3蛋白表达；Westernblot方法检测LC3、beclin-1、p62、mTOR、p-mTOR蛋白表达；流式细胞数检测细胞自噬强度；透射电镜检测细胞超微结构。(2)检测自噬抑制剂3MA对RT作用Raw264.7细胞自噬的作用采用MTT方法检测3MA对细胞存

3、活率的影响；WesternBlot检测LC3蛋白表达。(3)检测P38MAPK信号通路对RT作用Raw264.7细胞自噬的作用采用WesternBlot方法检测P38MAPK和p-p38MAPK蛋白表达。实验结果：(1)RT对小鼠巨噬细胞系Raw264.7细胞自噬的作用MTT检测RT对Raw264.7细胞存活率结果显示，RT作用小鼠巨噬细胞系Raw264.7细胞24h和48h后，RT对Raw264.7细胞的存活率具有时间和剂量依赖性。作用24h时，RT作用Raw264.7细胞的半数致死浓度大概在100ng/mLI左右。

4、采用免疫荧光方法检测LC3蛋白表达。激光共聚焦结果显示，同对照组相比，两组阳性对照中LC3蛋白表达量增高，RT作用Raw264.7细胞1h，2h，4h后，结果显示LC3蛋白表达量显著增高。采用WesternBlot方法检测LC3、Beclin-1、P62、mTOR、p-mTOR蛋白表达结果显示，除了mTOR蛋白，其余所有蛋白表达均比对照组高。RT分别作用1h、2h、4h后，LC3蛋白表达量明显增多；Beclin-1蛋白表达先增加后降低；P62蛋白表达随着时间延长，表达量降低；mTOR蛋白表达无明显变化；而p-mTOR蛋

5、白表达比空白对照组强。采用流式细胞数检测细胞自噬的强度，所得流式结果显示，RT作用后，细胞自噬强度明显增强，作用2h后，细胞自噬强度最高。采用透射电镜观测细胞超微结构，透射电镜结果显示，RT作用细胞后，同对照组相比，自噬空泡显著增多，细胞体积明显变大，细胞器更加活跃。(2)3MA对RT作用小鼠巨噬细胞系Raw264.7细胞自噬的作用采用MTT方法检测加入3MA自噬抑制剂后，RT对小鼠巨噬细胞系Raw264.7细胞存活的影响，结果显示，加入3MA自噬抑制剂后，细胞死亡率增高。采用WesternBlot方法检测加入3MA自

6、噬抑制剂后，LC3蛋白表达情况。结果显示，加入3MA自噬抑制剂后，LC3蛋白表达量降低。(3)P38-MAPK信号通路对RT作用Raw264.7细胞后细胞自噬作用采用WesternBlot方法检测p38MAPK信号通路对细胞自噬的作用。结果显示，p38MAPK蛋白表达量无明显变化，而p-P38MAPK蛋白表达量增高。综合以上研究结果表明：低剂量的RT可以诱导小鼠巨噬细胞系Raw264.7细胞自噬，自噬发生时，自噬空泡明显增多，自噬相关蛋白表达增高；加入3MA自噬抑制剂后，细胞死亡率增加，说明细胞自噬在RT作用细胞的过程

7、中起到一定的保护作用；在自噬发生的过程中，其调控信号可能是通过P38MAPK信号通路进行的，具体机制还需进一步研究。关键词：蓖麻毒素，自噬，Raw264.7细胞，LC3，P38MAPKIIAbstractResearchontheeffectofricinonautophagyofmacrophagecelllineRaw264.7Ricinisoneofthemostpoisonoustoxicityinthenaturaltoxin,possessingstronglycelltoxity.Itwasreporte

8、dthathighdoseofricincansuppressproteinsynthesised,lowdoseofricincaninducecytokinedamaging,lipideoveroxidationdamagingandcanalsoinducecellapoptosis.However,autophagyex