lps诱导小鼠肺巨噬细胞氧化应激在自噬中的作用机制研究

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1、LPS诱导小鼠肺巨噬细胞氧化应激在自噬中的作用机制研究摘要目的：观察脂多糖（Lippolysaccride,LPS）对外源性过氧化氢（H2O2）刺激的小鼠肺巨噬细胞（Ana-1）的氧化损伤的影响，并通过Ana-1细胞DNA氧化损伤和自噬角度来研究LPS诱导对Ana-1细胞氧化应激和自噬的作用机制及其相关的分子机制。方法：1.LPS刺激Ana-1细胞模型的建立及LPS诱导下Ana-1细胞氧化应激损伤模型的影响。LPS作用于Ana-1细胞，彗星实验试剂盒检测Ana-1细胞DNA损伤的情况，ROS荧光探针-DHE检测Ana-1细胞内活性氧族物质（ReactiveOxygenSpec

2、ies,ROS）的表达情况，总SOD活性检测试剂盒（WST法）检测Ana-1细胞总超氧化物歧化酶（SuperoxideDismutase,SOD）的表达情况。LPS作用于氧化应激损伤下的Ana-1细胞，通过彗星实验试剂盒检测Ana-1细胞DNA损伤的情况，ROS荧光探针-DHE检测Ana-1细胞ROS的表达情况，总SOD活性检测试剂盒（WST法）检测Ana-1细胞总SOD的表达情况。比较LPS作用于Ana-1细胞与LPS作用氧化应激状态下的Ana-1细胞的指标变化情况。2.LPS作用下的Ana-1细胞自噬现象和LPS作用于氧化应激损伤下的Ana-1细胞自噬现象。LPS浓度为1

3、ug/ml刺激Ana-1细胞4小时后（LPS处理组），逆转录聚合酶链反应（RT-PCR）法检测自噬相关因子LC3-Ⅱ的mRNA表达水平变化，脂质体Lipofectamine2000转染质粒GFP-LC3（greenfluorescentprotein-microtubuleassociatedproteinlightchain3，绿色荧光蛋白-微管相关蛋白1轻链3）和质粒RFP-LC3（Redfluorescentprotein-microtubuleassociatedproteinlightchain3，红色荧光蛋白-微管相关蛋白1轻链3）观察LPS作用下的Ana-1细胞

4、的自噬现象，免疫蛋白印记（WesternBlot）法检测自噬基因BECN1蛋白和LC3Ⅰ/Ⅱ蛋白的表达。LPS作用氧化应激状态下的Ana-1细胞（LPS+H2O2处理组，外源性H2O2浓度为12.5uM刺激Ana-1细胞2h后，再加入LPS浓度为1ug/ml刺激Ana-1细胞4h），RT-PCR法检测自噬相关因子LC3的mRNA表达水平变化，脂质体Lipofectamine2000转染质粒GFP-LC3和质粒RFP-LC3观察自噬现象，WesternBlot法检测自噬基因BECN1蛋白和LC3Ⅰ/Ⅱ蛋白表达。维生素C抗氧化应激损伤处理后(维生素C浓度为2000ug/ml,刺激

5、1小时后加入H2O2，浓度为12.5uM刺激Ana-1细胞2h后，再加入LPS浓度为1ug/ml刺激Ana-1细胞4h)观察LPS介导下Ana-1细胞的自噬现象以及WesternBlot法检测自噬基因BECN1蛋白和LC3Ⅰ/Ⅱ蛋白表达。对照组用PBS刺激进行对比。比较对照组、LPS处理组和LPS+H2O2处理组以及维生素C处理组两两间所测指标的变化和差异。结果：1.LPS作用于Ana-1细胞，与对照组相比较，细胞内ROS的表达浓度增高，P<0.05具有统计学意义；总SOD的表达减少，P<0.01具有统计学意义；彗星实验检测出Ana-1细胞DNA有损伤，P<0.01具有统计学

6、意义提示LPS处理可诱导Ana-1细胞的氧化应激损伤。LPS处理后氧化应激状态下的Ana-1细胞内的ROS的表达浓度较LPS处理组明显增高，P<0.05具有统计学意义；总SOD的表达减少，P<0.01具有统计学意义；彗星实验检测出Ana-1细胞DNA有损伤，P<0.01具有统计学意义，细胞损伤明显。2.共聚焦显微镜下观察对照组、LPS处理组、LPS+H2O2处理组的ROS荧光强度和荧光数量发现：LPS处理组的ROS荧光强度和荧光数量与对照组相比较有所增加，P<0.01具有统计学意义；LPS+H2O2处理组的ROS荧光强度和荧光数量较LPS处理组明显增加，P<0.01具有统计学

7、意义。3.RT-PCR法检测自噬相关因子LC3-Ⅱ的mRNA表达水平变化示LPS+H2O2处理组较LPS处理组的LC3-Ⅱ的mRNA表达水平量多；LPS处理组较对照组的LC3-Ⅱ的mRNA表达水平量多。4.共聚焦显微镜下观察对照组、LPS处理组、LPS+H2O2处理组和维生素C处理组的细胞自噬GFP-LC3和RFP-LC3转染情况发现LPS处理组较对照组的自噬小体有所增加；LPS+H2O2处理组较LPS处理组的自噬小体在胞质内表达明显增加；维生素C处理组较LPS+H2O2处理组的自噬小体有所减少。5.W