lps诱导小鼠肺巨噬细胞氧化应激在自噬中的作用机制的研究

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1、protein-microtubuleassociatedproteinlightchain3，绿色荧光蛋白-微管相关蛋白1轻链3）和质粒RFP-LC3（Redfluorescentprotein-microtubuleassociatedproteinlightchain3，红色荧光蛋白-微管相关蛋白1轻链3）观察LPS作用下的Ana-1细胞的自噬现象，免疫蛋白印记（WesternBlot）法检测自噬基因BECN1蛋白和LC3Ⅰ/Ⅱ蛋白的表达。LPS作用氧化应激状态下的Ana-1细胞（LPS+H2O2处理组，外源

2、性H2O2浓度为12.5uM刺激Ana-1细胞2h后，再加入LPS浓度为1ug/ml刺激Ana-1细胞4h），RT-PCR法检测自噬相关因子LC3的mRNA表达水平变化，脂质体Lipofectamine2000转染质粒GFP-LC3和质粒RFP-LC3观察自噬现象，WesternBlot法检测自噬基因BECN1蛋白和LC3Ⅰ/Ⅱ蛋白表达。维生素C抗氧化应激损伤处理后(维生素C浓度为2000ug/ml,刺激1小时后加入H2O2，浓度为12.5uM刺激Ana-1细胞2h后，再加入LPS浓度为1ug/ml刺激Ana-1细

3、胞4h)观察LPS介导下Ana-1细胞的自噬现象以及WesternBlot法检测自噬基因BECN1蛋白和LC3Ⅰ/Ⅱ蛋白表达。对照组用PBS刺激进行对比。比较对照组、LPS处理组和LPS+H2O2处理组以及维生素C处理组两两间所测指标的变化和差异。结果：1.LPS作用于Ana-1细胞，与对照组相比较，细胞内ROS的表达浓度增高，P<0.05具有统计学意义；总SOD的表达减少，P<0.01具有统计学意义；彗星实验检测出Ana-1细胞DNA有损伤，P<0.01具有统计学意义提示LPS处理可诱导Ana-1细胞的氧化应激损

4、伤。LPS处理后氧化应激状态下的Ana-1细胞内的ROS的表达浓度较LPS处理组明显增高，P<0.05具有统计学意义；总SOD的表达减少，P<0.01具有统计学意义；彗星实验检测出Ana-1细胞DNA有损伤，P<0.01具有统计学意义，细胞损伤明显。2.共聚焦显微镜下观察对照组、LPS处理组、LPS+H2O2处理组的ROS荧光强度和荧光数量发现：LPS处理组的ROS荧光强度和荧光数量与对照组相比较有所增加，P<0.01具有统计学意义；LPS+H2O2处理组的ROS荧光强度和荧光数量较LPS处理组明显增加，P<0.0

5、1具有统计学意义。3.RT-PCR法检测自噬相关因子LC3-Ⅱ的mRNA表达水平变化示LPS+H2O2处理组较LPS处理组的LC3-Ⅱ的mRNA表达水平量多；LPS处理组较对照组的LC3-Ⅱ的mRNA表达水平量多。4.共聚焦显微镜下观察对照组、LPS处理组、LPS+H2O2处理组和维生素C处理组的细胞自噬GFP-LC3和RFP-LC3转染情况发现LPS处理组较对照组的自噬小体有所增加；LPS+H2O2处理组较LPS处理组的自噬小体在胞质内表达明显增加；维生素C处理组较LPS+H2O2处理组的自噬小体有所减少。5.W

6、esternBlot法检测自噬基因BECN1蛋白表达示LPS+H2O2处理组较LPS处理组的BECN1表达水平量增多，P<0.01具有统计学意义；LPS处理组较对照组的BECN1表达水平量增多，P<0.01具有统计学意义。WesternBlot法检测自噬基因LC3Ⅰ/Ⅱ蛋白表达示维生素C处理组较LPS+H2O2处理组的LC3表达水平量减少，P<0.05具有统计学意义；LPS+H2O2处理组较LPS处理组的LC3表达水平量增多，P<0.05具有统计学意义；LPS处理组较对照组的LC3表达水平量增多，P<0.05具有统

7、计学意义。结论：1.外源性H2O2可诱导小鼠肺巨噬细胞Ana-1的氧化应激，导致细胞损伤。LPS能加重H2O2诱导小鼠肺巨噬细胞Ana-1的氧化应激，加重细胞的DNA损伤。2.LPS能加重氧化应激下小鼠肺巨噬细胞Ana-1的自噬。氧化应激下小鼠肺巨噬细胞Ana-1的自噬与氧化应激细胞DNA损伤有关，LPS能加重这一现象可能是通过上调自噬相关蛋白BECN1和LC3的表达。3.通过抗氧化剂维生素C的处理发现，维生素C能减少LPS介导氧化应激的小鼠肺巨噬细胞Ana-1的自噬基因LC3Ⅰ/Ⅱ蛋白表达以及质粒GFP-LC3和

8、质粒RFP-LC3表达，再次证明LPS通过加强氧化应激小鼠肺巨噬细胞Ana-1的细胞损伤，从而加重细胞自噬现象。关键词：小鼠肺巨噬细胞；氧化应激；自噬；脂多糖；维生素CResearchonLPS-inducedOxidativeStressandAutophagyofAna-1PulmonaryMacrophageAbstract:Objective:Too