小鼠sst2基因真核表达及其对lps活化raw264.7巨噬细胞的调节作用

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1、小鼠sST2基因真核表达及其对LPS活化RAW264.7巨噬细胞的调节作用作者：尹辉,龚权,杨衡,熊平,郑芳龚非力【摘要】目的:克隆并构建含小鼠sST2和人IgGFc融合基因的真核表达质粒,初步探讨其表达产物sST2Fc融合蛋白对LPS刺激小鼠巨噬细胞生物学活性的影响。方法:借助RTPCR技术,从小鼠脾脏总RNA中扩增全长sST2cDNA,构建sST2与hIgGFc段融合基因的真核表达载体（psST2Fc）。应用脂质体将重组质粒psST2Fc转染CHO细胞,经G418筛选,获得稳定表达sST2Fc融合蛋白的CHO细胞株。细胞培养上清经蛋白A亲和层析

2、纯化后,采用Westernblot进行鉴定,应用FACS检测sST2Fc与RAW264.7巨噬细胞表面相应受体结合情况;ELISA法检测sST2Fc对LPS刺激RAW264.7巨噬细胞分泌TNFα和IL6的影响。结果:测序证实克隆和构建的小鼠sST2FccDNA阅读框序列正确,Westernblot证实sST2Fc融合蛋白的表达,sST2Fc抑制LPS诱导巨噬细胞分泌的炎性细胞因子TNFα和IL6。结论:成功构建sST2Fc融合基因并获得稳定表达,sST2Fc通过与其特异性受体结合可抑制巨噬细胞介导的炎性反应。【关键词】小鼠sST2F

3、c;真核表达;RAW264.7;TNFα;IL610ST2最早被认为是由成纤维细胞分泌的一种血清免疫应答产物,随后发现肥大细胞［1］和Th2细胞［2］表面存在一种跨膜型ST2,但其不表达在Th1细胞表面。目前证实ST2属于IL1受体超家族成员,但不能与IL1家族成员IL1α、IL1β或IL1R拮抗剂结合。由于在mRNA水平剪切方式的差异,ST2基因表达产物以跨膜型（ST2L）和分泌型(sST2)两种形式存在,前者主要分布在源于造血细胞的细胞表面如肥大细胞和嗜酸性粒细胞,而后者主要由成纤维细胞分泌产生。近来研究显示,ST2除了诱导免疫应答由Th1

4、型向Th2型偏移,还涉及到类风湿性关节炎、过敏性哮喘等多种疾病的发生发展［3,4］。我们通过构建小鼠sST2人IgG1Fc重组质粒（psST2Fc）并表达可溶性ST2Fc融合蛋白,观察其对LPS诱导RAW264.7巨噬细胞生物学活性的影响,为进一步应用该分子治疗炎症相关性疾病奠定基础。1材料和方法1.1材料BALB/c小鼠(8～12周龄,雄性)由湖北省医学实验动物中心提供;CHO细胞购自中国典型培养物保藏中心;RAW264.7巨噬细胞由华中科技大学同济医学院免疫学系保藏。单克隆大鼠抗小鼠ST2抗体购自R&D公司。LPS和人IgG标准品购自Sig

5、ma公司,TRIzol试剂和脂质体LipofectAMINETM2000购自Invitrogen公司,RTPCR试剂盒购于MBI公司。各种限制性内切酶和T410DNA连接酶购自Promega公司。SepharoseCL4B蛋白A亲和层析柱购自AmershamBiosciences。DNA合成和测序由Invitrogen(上海)完成。1.2方法1.2.1重组表达载体的构建采用TRIzol试剂提取BALB/c小鼠脾细胞总RNA,经RTPCR扩增全长sST2cDNA。PCR引物的序列为:5′AAAACAAGCTTGGCCGCCACCATGATTGACAGA

6、CAGAG3′和5′AAAACGGATCCGAGCAATGTGTGAGGGACACTCCT3′。采用HindIII和BamHI分别双酶切sST2和载体pcDNA3.1Fc,将酶切片段sST2插入pcDNA3.1Fc载体Fc的上游,构建重组表达载体psST2Fc,转化E.coliDH5α宿主菌,筛选阳性克隆,经酶切和测序鉴定。1.2.2转染与筛选用QIAGEN质粒试剂盒提取重组表达载体pcDNA3.1sST2Fc,采用脂质体LipofectamineTM2000转染CHO细胞,同时转染空载体pcDNA3.1和未转染细胞作为阴性对照。具体方法为:

7、CHO细胞在含100mL/L胎牛血清的DMEM中,于37℃、50mL/LCO2饱和湿度下培养。转染前1d,细胞用2.5g/L胰酶消化并接种于24孔培养板中（细胞数为1×105/孔）,待细胞融合至70％～80％时,按LipofectamineTM2000试剂说明书进行转染,并设空载体和未转染组对照。培养48h后,加入G418(800mg/L)筛选阳性抗药克隆。101.2.3sST2Fc蛋白的纯化及鉴定收集细胞培养上清用SepharoseCL4B蛋白A亲和层析柱纯化sST2Fc融合蛋白,纯化样品的浓度用A280吸收法测定。采用Westernblot鉴定sS

8、T2Fc蛋白表达,一抗为单克隆大鼠抗小鼠ST2抗体