γ射线与lps作用于小鼠巨噬细胞raw264.7的生物学效应

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1、γ射线与LPS作用于小鼠巨噬细胞RAW264.7的生物学效应作者：饶亚岚,丛悦,陈肖华*,董波,李峰生,张军权,高玲,毛秉智【摘要】目的:研究γ射线与LPS协同激活小鼠巨噬细胞RAW264.7的效应机制,以及γ射线与LPS诱导钙结合蛋白S100A8的表达及意义。方法:相差显微镜观察细胞形态;流式细胞计数方法检测细胞周期及活性氧介质（ROI）水平;Griess颜色反应测定细胞NO水平;实时定量RTPCR方法检测细胞S100A8mRNA水平的表达。结果:γ射线与LPS作用于RAW264.7细胞引起细胞形态改变,部分细胞出现非整倍性,少量细胞出现凋亡,胞内ROI水平、NO水平明显升高,S100

2、A8分子mRNA水平明显升高,而且这些效应几乎都比γ射线或LPS单因素的作用要强。结论:γ射线与LPS协同诱导巨噬细胞激活是细胞周期改变、信使分子水平变化、炎症因子如S100A8的表达等多方面生物效应的综合结果,其中S100A8基因的表达与巨噬细胞功能状态密切相关。【关键词】巨噬细胞;γ射线;LPS;S100A8巨噬细胞在整个免疫反应中起极为重要的作用,10辐射后许多组织和器官损伤都涉及到巨噬细胞的功能异常,巨噬细胞的辐射效应一直受到重视。巨噬细胞通常具有辐射抗性,但已有多篇报道证明电离辐射能够促进或直接激活巨噬细胞。一氧化氮（nitricoxide,NO）的生成是巨噬细胞被激活的重要标志

3、,单纯的射线不能引起小鼠巨噬细胞J774.1和RAW264.7细胞中NO水平的改变,但0.5～10Gy射线预处理能够触发这些巨噬细胞为干扰素γ（interferonγ,IFNγ）和（或）脂多糖（lipopolysaccharide,LPS）诱导生成NO,而且呈现剂量效应关系［1］。钙结合蛋白S100A8是S100蛋白家族成员,是一个多功能分子,其最主要的功能是参与免疫炎症反应过程［2］。Stassen等［3］研究发现,6GyX射线照射MCF7细胞后48～72h,S100A8被诱导表达,其mRNA水平呈现辐射剂量效应关系。静息态的巨噬细胞不表达S100A8,激活状态的巨噬细胞才表达S1

4、00A8分子,S100A8在巨噬细胞中为LPS等炎症因子诱导表达［4］。既然S100A8能够为电离辐射及LPS诱导表达,那么我们需要进一步研究在巨噬细胞中,电离辐射是否与LPS协同诱导S100A8以及S100A8的表达与巨噬细胞功能状态之间的关系。本研究观察比较了RAW264.7细胞受10Gyγ射线照射后24h,5mg/LLPS继续处理24h与正常对照、相应单纯γ射线或单纯LPS处理组细胞形态、周期、活性氧介质（reactiveoxygenintermediates,ROI）水平、NO水平及S100A8mRNA等指标的改变并探讨相互之间的关系。101材料和方法1.1材料试剂LPS、2’7

5、’二氯荧光素双醋酸盐(2,7dichlorofluorescindictate,DCFHDA)、碘化丙啶(propidiumiodide,PI)为美国Sigma公司产品。RPMI1640培养基干粉、胎牛血清、TRIzol试剂为美国Invitrogen公司产品。随机引物、MMLV逆转录酶为美国Promega公司产品。BioEasySYBRGreenIRealTimePCRKit为杭州博日公司产品。FACSCalibur流式细胞仪为美国BD公司产品。Linegene荧光定量PCR检测系统为杭州博日公司产品。1.2方法1.2.1RAW264.7细胞培养及处理小鼠巨噬细胞RAW264.

6、7细胞于含100mL/L胎牛血清的RPMI1640培养液,37℃、50mL/LCO2饱和度条件下培养。对数增殖期细胞照射前24h,换新鲜培养基,不辐射或10Gy60Coγ射线照射,照射后24h,不加或加入5mg/LLPS,继续培养24h。相差显微镜观察细胞形态变化。1.2.2流式细胞术测定细胞周期乙醇固定骨髓单细胞悬液,PI染色,流式细胞仪检测,具体按文献［5］进行。101.2.3流式细胞术测定ROI水平约1×106RAW264.7细胞铺种于6孔板中,培养过夜,γ射线或(和)LPS处理后不同时间收集细胞,用无血清RPMI1640培养液洗2遍细胞后,20μmol/LDCFHDA悬浮细胞,3

7、7℃孵育30min,无血清RPMI1640培养液洗涤1遍后,0.5mL无血清RPMI1640培养液悬浮细胞,流式细胞仪检测。1.2.4NO水平检测通过Griess颜色反应测定细胞培养上清中NO-2水平,NO-2水平以吸光值A550表示,具体方法参照文献［1］进行。1.2.5实时定量RTPCR检测S100A8表达用TRIzol试剂提取RAW264.7细胞总RNA,经紫外分光仪检测A260和A280,测定浓度和纯度。取总R