RAW264.7小鼠巨噬细胞protocol.doc

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1、RAW264.7细胞株的相关信息ATCC:美国模式培养物集存库(Americantypeculturecollection)的简写收到冷冻管细胞的处理方式1.收到细胞株包裹时，请检查细胞株冷冻管是否有解冻情形，若有请立即通知。细胞株请尽速开始培养，或立即冷冻保存(置于–70℃，隔夜后，移到液氮)。 2.收到T25flask细胞的处理方式于寄送过程中，为避免起泡造成细胞脱落死亡，T25flask均加满培养基。2.1.  检查flask外观，并于显微镜下观察细胞生长状况和有无污染现象，若有任何问题，不要打开

2、盖子，请立即通知细胞实验室。2.2.  将原封之T25flask静置于37℃，5%CO2培养箱中，使细胞回温至37℃，并让运送过程中少数脱落的细胞可再附着生长。2.3.  隔天后，于无菌操作箱取出flask之培养基，(取出之培养基可以再使用)，仅留约5-10ml培养基于flask，依一般培养方式再将细胞置入培养箱中，或细胞已长满盘，则将细胞做传代培养。RAW264.7细胞株的CellCulture一、RAW264.7细胞培养的特点1、RAW264.7细胞一般为圆形或椭圆形，功能活跃时，可呈多突形。细胞核

3、为圆形或椭圆形，染色较深。贴壁特别牢固。2、RAW264.7具有很强的吞噬能力，当吞噬抗原后，细胞会释放趋化因子，进一步促进细胞伸出伪足，增强粘附攀爬能力。细胞吞噬抗原过多、培养环境恶劣都会促进该细胞呈现梭形、长梭形，镜下会看到具有细长伪足的小细胞被类似上皮的梭形大细胞取代。3、每次传代都很难消化下来。用力过大则对细胞损伤较大，这种细胞传代时接种密度要大，否则容易使巨噬细胞向终末细胞分化，细胞变成长形，并且不能回复，这是培养这种细胞时最需要注意的问题。4、对于RAW264.7细胞他的声场时喜欢结伴。正常

4、生长状态应该是一小片一小片的生长，片片之间不连接，等到长到更多更密的时候会连成大片，并且会叠加成层。所以，要很好地控制好细胞的生长速度，不要等到叠加成层的时候再传代。5、RAW264.7细胞传代后贴壁时间较短，半小时就能贴很多，刚贴壁是细胞呈圆形，折光度很好，镜下观察如小珍珠状一个个地散落于瓶底面。生长一段时间后，部分细胞会变成类似四角形，伸出伪足之类的。这个时候就是提醒你注意传代了，这部分细胞如再不传代，很容易就老化掉。二、RAW264.7细胞传代1)将培养瓶旧的培养液弃掉，然后用D-Hanks液洗两

5、次，(一定要洗干净，以免影响胰酶的消化作用)2)加入0.25%胰酶-EDTA消化，25cm培养瓶加0.4ml，37度消化5min，镜下看到细胞变圆，间隙增大。（值得注意的是该细胞对机械损伤比较敏感）3)立即加含10%FCS的培养液终止消化，用细胞刮刀轻刮，注意，这时候用吸管吹不下来，但是刮刀却很容易刮下来，而且对细胞的损伤极小4)离心，弃上清，加新的培养液(10%FCS)，小心吹匀，分装入新的培养瓶三、RAW264.7细胞冻存及复（一）细胞冻存1.配制冻存培养液；（通用的为培养基：血清：DMSO=7：2

6、：1，但其中的血清可进行调整，如上面的仁兄用的4：5：1，比例过高）2.取对数生长期的细胞（冻存前一天换液），用胰蛋白酶把单层生长的细胞消化下来，悬浮生长的细胞则直接将细胞移至15ml离心管中；3.离心1000rpm，5min；4.去除胰蛋白酶及旧的培养液，加入适量配制好的冻存培养液，用吸管轻轻吹打使细胞均匀，计数，调节冻存液中细胞的最终密度为5×106/ml～1×107/ml；5.将细胞分装入冻存管中，每管1～1.5ml（不超过冻存管容量的80%）；6.在冻存管上标明细胞的名称，冻存时间及操作者；7.

7、冻存：标准的冻存程序为降温速率-1～-2℃/min；当温度达-25℃以下时，可增至-5℃～-10℃/min；到-100℃时，则可迅速浸入液氮中。也可将装有细胞的冻存管放入-20℃冰箱2h，然后放入-70℃冰箱中过夜，取出冻存管，移入液氮容器。（具体操作为4°C20min，-20°C30min，-70℃过夜，转入液氮中）（二）细胞复1.从液氮容器中取出冻存管，直接浸入37℃温水中，并不时摇动令其尽快融化。（1min以溶解完毕，不能将口进入水面下）2.从37℃水浴中取出冻存管，打开盖子，用吸管吸出细胞悬液，

8、加到离心管并滴加10倍以上培养液，混匀；3.离心，1000rpm，5min；4.弃去上清液，加入含10%小牛血清培养液重悬细胞，计数，调整细胞密度，接种培养瓶，37℃培养箱静置培养；(复时细胞密度稍大，可提高复效率)5.次日更换一次培养液，继续培养。（可更换一半培养液，避免跨度太大，影响细胞状态）（三）接种四、RAW264.7细胞形态不好时的处理方法1.倒掉旧的培养基，加入3ml新的培养基（有无血清的都可）洗涤一次，用滴管吸走，然后再加入3