姜黄素对顺铂耐药肺癌细胞EMT抑制作用及机制探讨

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1、单位代码10475申请编号10475201200569分类号R734.2硕士学位论文（同等学力）姜黄素对顺铂耐药肺癌细胞EMT抑制作用及机制探讨学科、专业：内科学研究方向：肺肿瘤申请学位类别：医学硕士申请人：王慧指导教师：杜耀武二〇一七年六月EffectsofcurcuminonEMTofCDDP-resistantlungcancercelllineanditsmechanismADissertationSubmittedtotheGraduateSchoolofHenanUniversityinPartial

2、FulfillmentoftheRequirementsfortheDegreeofMasterofMedicineByWanghuiSupervisor:AssociateProfessor.DuYaowuJune2017摘要背景近些年来，肺癌的发病率越来越高，而且呈年轻化趋势，对我国居民的身心健康造成严重威胁。化疗是肺癌治疗的主要方式之一，但是化疗过程中肿瘤细胞容易产生多药耐药性(Multidrugresistance,MDR)，而MDR细胞易发生上皮细胞-间质转化（epithelial-mesenchyma

3、ltransition,EMT）。EMT的发生会促进肺癌侵袭、转移，严重影响病人的预后和生存期，在上皮细胞转变成间质细胞的过程中，细胞的形态特征发生变化、获得了间质细胞的分子标记物，具有更强的侵袭和迁移能力。EMT是受多种转录因子调控的，Wnt/β-catenin-Snail信号通路是重要的调控通路之一，Wnt/β-catenin广范分布于真核细胞中，具有多种调节功能，可被多种细胞因子或化疗药物激活，与肿瘤细胞的MDR密切相关。近年来，研究者致力于肿瘤耐药逆转剂的开发研究，期望针对耐药性和恶性程度更高的肺癌病例能

4、寻找到更有效的治疗方案。姜黄素是一种植物多酚，能够通过不同机制促进肿瘤细胞凋亡、抑制多种肿瘤细胞增殖、抑制肿瘤细胞扩散和逆转肿瘤细胞的耐药性。已有学者证实，姜黄素可以通过抑制Wnt/β-catenin通路的激活，进而下调Wnt/β-catenin下游的重要转录因子Snai的表达，达到抑制癌细胞EMT的作用。因为耐药细胞容易发生EMT，而EMT与肿瘤细胞的转移及浸润密切相关，我们提出假设：姜黄素可能通过Wnt/β-catenin-Snail信号通路抑制EMT来发挥抗耐药肺癌侵袭的作用。目的本研究主要以耐顺铂肺癌细胞

5、为主要研究对象，通过体外实验观察姜黄素对耐顺铂肺癌细胞EMT的抑制及探讨初步的机制，为耐药肺癌的治疗提供理论依据。方法1.采用中等浓度间歇作用法建立肺癌顺铂耐药细胞，命名为A-549/CDDP，MTT法测定细胞的耐药指数及交叉耐药性，以不同浓度的姜黄素处理A-549/CDDP细胞48h，检测其对耐药细胞增殖的抑制。I2.细胞骨架染色、Transwell细胞迁移侵袭实验来检测姜黄素对A-549/CDDP细胞形态变化、迁移和侵袭能力的影响。3.荧光定量PCR和Westernblot分别检测在姜黄素处理前后A-549/

6、CDDP细胞中EMT相关分子标志物E-钙黏蛋白(E-cadherin)，间质细胞的分子标记N-钙黏蛋白(N-cadherin)、波形蛋白(Vimentin)、纤维连接蛋白（Fibronectin）在mRNA和蛋白水平表达变化。4.荧光定量PCR检测在姜黄素处理前后A-549/CDDP细胞中基因β-catenin、Axin2、C-myc、Wntless、Slug，Snail，ZEB1，Twist1在mRNA水平的表达变化。5.WesternBlot检测抑制剂Dkk1(20μmol/L)刺激A-549/CDDP细胞后

7、，姜黄素对E-cadherin、N-cadherin、vimentin以及β-catenin、Wntless、Snail表达的影响。结果1.成功建立了肺癌顺铂耐药细胞A-549/CDDP，耐药指数为54.46，对阿霉素、5-氟脲嘧啶、紫杉醇产生交叉耐药性，姜黄素对A-549/CDDP细胞的增殖有抑制作用，这种抑制作用呈剂量依赖性。2.Transwell迁移侵袭实验中，在30μmol/L浓度的姜黄素作用下，A-549/CDDP组细胞的迁移和侵袭明显慢于对照组，差异有统计学意义。3.细胞骨架染色观察姜黄素对A-549

8、/CDDP细胞形态的影响，罗丹明细胞骨架蛋白染色显示，A-549/CDDP细胞与A-549亲本细胞相比，细胞发生上皮间质化，细胞形态不规则，呈纺锤样及成纤维细胞样细胞表型。在姜黄素作用下，细胞膜肌动蛋白凝集，细胞收缩。4.与A-549细胞相比，耐药细胞的E-cadherin在mRNA及蛋白水平的表达明显下调，而N-cadherin及Vimentin在mRNA及蛋白的水平的