抑制内皮祖细胞自噬对在血栓机化再通的实验研究(二)

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1、硕士学位论文论文题目抑制内皮祖细胞自噬对在血栓机化再通的实验研究（二）研究生姓名蔡志新指导教师姓名李晓强专业名称外科学研究方向血管外科学论文提交日期2013年4月抑制内皮祖细胞自噬对在血栓机化再通的实验研究（二）中文摘要抑制内皮祖细胞自噬对在血栓机化再通的实验研究（二）中文摘要目的：应用适量自噬抑制剂3-MA（3-甲基腺嘌呤）作用于内皮祖细胞（endothelialprogenitorcells，EPCs）后，移植到大鼠深静脉血栓模型体内，探讨干预后的EPCs在血栓机化再通中的作用，进而为下肢深静脉血栓治疗提供一种新的思路和实验依据。方法：1.Ficoll密度梯度离心法获取SD

2、大鼠来源的骨髓单个核细胞（bonemarrow-derivedmononuclearcells，BMMNCs），经内皮祖细胞培养基（EGM-2MV）体外诱导、培养、扩增EPCs，在倒置显微镜观察细胞形态学特征，MTT法检测EPCs增殖情况。采用内皮细胞系列标志：CD133、CD34免疫荧光技术及VEGFR-2、vWF免疫组化对其进行鉴定。利用三维培养实验证实EPC具有形成血管能力。采用MTT比色法测定各浓度3-MA及对照组EPCs增殖的作用。2.血栓模型建立：采用缩窄肾下段下腔静脉结合三氯化铁浸润破坏血管内膜方法建立大鼠深静脉血栓模型，并饲养至10天，备移植用。动物随机分四组，

3、经大鼠股静脉穿刺注射移植液体。A组(n=15)：空白对照组，注射生理盐水；B组（n=15）6EPCs移植组，移植lml含有10个EPCs的细胞悬液；C组(n=15)：注射3-MA稀释液（5mmol/l）；D组(n=15)：移植1ml含有经5mol/l3-MA处理后的EPCs的细胞悬液。3．移植后分四个时间段（0天、7天、14天、28天）取出血栓段下腔静脉及血栓，应用免疫组织化学法检测各组血栓中新生血管及机化再通的情况。实时荧光定量PCR检测各组标本中VEGF，bFGF，MCP-1，Ang-1mRNA表达情况。4．采用SPSSl7．0软件进行分析。结果：1.刚分离的骨髓单个核细胞

4、(BMMNCs)大小不一，呈圆形，第3天左右细胞逐渐贴壁，细胞形态多样，呈梭形、卵圆形、纺锤形、三角形或不规则形，一周左右可见细胞集落、细胞呈线状排列，第10天左右细胞呈典型鹅卵石样外观。细胞生长曲线I中文摘要抑制内皮祖细胞自噬对在血栓机化再通的实验研究（二）呈“S”形，EPCs在培养的5~11天时增殖较快，13天后进入平台期，生长曲线呈典型“S’’形外观。贴壁细胞的CD34、VEGF、vWF、CD133均表达阳性。成血管实验显示：EPCs细胞间首尾相连，形成管腔样结构。MTT显示，与对照组相比较，3-MA在浓度5mmol/l对于EPCs的增殖有明显的促进作用。2.体外成功诱导

5、培养了大鼠骨髓源性EPCs；vWF免疫组化显示D组的血栓再通毛细血管密度明显高于其他三组，D、B之间差异有统计学意义；A、C组之间差异无统计学意义；RT-PCR结果显示A、B、C、D组VEGF，bFGF，MCP-1，Ang-1基因均有表达，D组较A、B、C组明显上调(P<0．05)；B组较A、C组表达上调（P<0.05）；A组与C组之间差异无统计学意义。结论：通过适度的自噬抑制，可促进EPCs增殖，移植后血栓内血管的新生能力明显增强，加快了血栓的机化和再通。关键词：内皮祖细胞自噬血栓机化再通作者：蔡志新指导教授：李晓强本课题受国家自然科学基金资助II抑制内皮祖细胞自噬对在血栓机

6、化再通的实验研究（二）英文摘要TheorganizationandrecanalizationofveinthrombosisafterinhibitionofautophagyinendothelialprogenitorcellsAbstractObject:Induceddifferentiationofendothelialprogenitorcells(endothelialprogenitorcells,EPCs)invitro;TransplantedtheEPCswhichwasintervenedbytheinhibitorofmacroautophagy(3

7、-MA),thendiscussedtheroleofEPCsinrecanalizationandtheneovascularization.Sowecanprovideanewwayandexperimentalbasisforthetreatmentofdeepveinthrombosis.Method:1.BMMNCswereisolatedfromratbonemarrowthroughficollandculturedwithEGM-2MVmediumcultivation.Ob