探讨内皮祖细胞大自噬和分子伴侣介导自噬相互作用的实验研究

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1、苏州大学学位论文独创性声明本人郑重声明：所提交的学位论文是本人在导师的指导下，独立进行研究工作所取得的成果。除文中已经注明引用的内容外，本论文不含其他个人或集体已经发表或撰写过的研究成果，也不含为获得苏州大学或其它教育机构的学位证书而使用过的材料。对本文的研究作出重要贡献的个人和集体，均已在文中以明确方式标明。本人承担本声明的法律责任。论文作者签名：圈逸蛰丛日期：2竺丝：￡二2么剌I大学学位论文使用授权声明J煳燃本人完全了解苏州大学关于收集、保存和使用学位论文的规定，即：学位论文著作权归属苏州大学。本学位论文电子文档的内容和纸质论文的内容相一致。苏州大学有权向国家图书馆、中国社科

2、院文献信息情报中心、中国科学技术信息研究所(含万方数据电子出版社)、中国学术期刊(光盘版)电子杂志社送交本学位论文的复印件和电子文档，允许论文被查阅和借阅，可以采用影印、缩印或其他复制手段保存和汇编学位论文，可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索。涉密论文日本学位论文属在竺!三年』月解密后适用本规定。非涉密论文口论文作者签名：导师签名：国缉．j日垄鸯日期：五[2：￡![么期：2z2：￡：!／探讨内皮祖细胞大自噬和分子伴侣介导白噬相互作用的实验研究中文摘要探讨内皮祖细胞大自噬和分子伴侣介导自噬相互作用的实验研究中文摘要目的：体外诱导分化内皮祖细胞(endothelia

3、lprogeIlitorcells，EPcs)，然后应用大自噬激活剂雷帕霉素、大自噬抑制剂3埘A(3一甲基腺嘌呤)干预，探讨干预后的EPCs中大自噬和分子伴侣介导的自噬生物学特性的变化，为下肢深静脉血栓等疾病的治疗提供一种新的思路和实验依据。方法：1．FicoU密度梯度离心法获取SD大鼠的骨髓单个核细胞(bonemarrow司嘶vedmononuclearcells，BMMNCs)，内皮祖细胞培养基(EGM-2MV)体外诱导分化为EPCs并进行鉴定。观察细胞形态学、增殖活性、内皮细胞系列标志vEGFR-2、vwF免疫组化，祖细胞标志CDl33、CD34免疫荧光技术动态鉴定。利用三

4、维培养实验鉴定EPC是否具有形成血管功能。2。将贴壁EPCs细胞随机分成2组，一组为雷帕霉素组，包括对照组(正常培养组)及雷帕霉素六个浓度组lp∥L、2．5p∥L、5“∥L、10p∥L、20肛∥L、40p∥L的EGM-2Mv培养基中。另一组为3埘A组，包括对照组及3一甲基腺嘌呤(3哪ethlvadeIline3埘A)六个浓度组，分别为1．25InIIlo坍、2．5mmoⅥ、5mm01／l、lOmmo觇、20mmoⅥ、40mmoⅥ。各组分别培养24h。2．1采用常规四氮唑蓝(memylthiazolvltetLazoliumMTT)比色法测定各浓度3埘A组、雷帕霉素组及对照组对EP

5、Cs增殖的作用。2．2利用westemblot检测LC3一II、LAMP2A蛋白表达的变化。2．3利用免疫荧光方法分析LAMP2A蛋白荧光强度变化。结果：1．新分离的骨髓单个核细胞(BMMNcs)呈圆形，大小不一，第3天左右大部分细胞开始贴壁，形态有梭形、三角形、纺锤形或不规则形，第5_8天左右出现细胞集落和细胞线状排列，第8—12天接近融合，呈典型鹅卵石样外观。细胞生长曲线呈，“S”形，EPCs在培养的6。1l天增殖较快，11天后进入平台期，生长曲线呈典型“s”形外观。贴壁细胞的CD34、vEGFR、vwF、CDl33均表达阳性。早期EPCs细胞增殖明显，但未形成管腔样结构。晚

6、期EPCs增殖明显，形成网状连接的管腔样结构。中文摘要探讨内皮祖细胞大自噬和分子伴侣介导自噬相互作用的实验研究2．经雷帕霉素作用后测定的OD值呈明显降低的趋势，对照组明显高于干预组(P

7、(P