hmgb促进细胞自噬分子机制的研究

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1、第四章HMGB1促进细胞自噬分子机制的研究在雷帕霉素靶位激酶的下游，有二十多种自噬相关基因(Atg)，编码蛋白质调控自噬活动，如p53、AMPK、DAPK等。酵母Atg6同源蛋白B细胞淋巴瘤-2-相互作用蛋白-1(B-celllymphoma-2-interactingprotein-1,Beclin-1)基因，也是通过调控细胞自噬和维持机体稳定的重要因子。胞外的HMGB1可以与单链寡核苷酸类形成复合物，增强其免疫刺激活性。HMGB1可以和许多分子形成复合物发挥生物学作用，例如和LPS形成复合物活化TLR4，诱导单核细胞产生更多的TNF-α；与RAGE的交互作用可

2、促进趋化作用和细胞因子的产生，通过激活NF-κB诱导炎症反应。HMGB1促进细胞自噬的发生也与其相关。本研究欲研究HMGB1调节细胞自噬所依赖的分子机制。4.1实验仪器和材料4.1.1实验仪器倒置显微镜Olympus公司CO2恒温细胞培养箱Forma公司超净工作台苏州尚田洁净有限公司电子分析天平BS224S（北京赛多利斯仪器有限司）超低温冰箱ULT-790-3V（Thermo）超纯水分离系统PL5243（Pall）低温台式高速离心5810REppendorf公司荧光定量PCR仪Roto-gene6000(CorbettResearch)PCR扩增仪2720Ther

3、malCycler(AppiledBiosystem)水平凝胶电泳槽pac-300（Bio-Rad）蛋白垂直电泳仪Jim-X（Bio-Rad）凝胶成像及分析系统ChampionChemical（北京赛智公司）超声波破碎仪XL2020核酸蛋白测定仪NanoDrop1000（Thermo）4.1.2实验材料细胞培养皿Corning6孔、24孔培养板CorningPVDF膜Bio-Rad细胞冻存管Axgen4.1.3主要试剂DMEM培养基、小牛血清购自Gibco公司，ECL显色剂、鼠抗小鼠β-actin抗体购自康为世纪公司，兔抗小鼠NF-κB抗体购于Immunoway公

4、司，兔抗小鼠LC3-Ι/LC3-II抗体、兔抗小鼠p-ERK1/2抗体购自CellSignalingTechnology公司，兔抗小鼠Beclin-1抗体购自MBL公司，HRP标记的羊抗小鼠IgG购自博士德公司，预染彩虹蛋白marker购自Fermentas公司，BSA购自Roche公司，逆转录试剂盒、ex-Taq酶、dNTP、DL2000Marker、6xloadingbuffer购自日本Takara公司4.1.4细胞系C57来源的小鼠肺癌细胞Lewis细胞4.1.5主要溶液配制（1）PBS缓冲液（pH7.2）：Kcl0.2g，Nacl8.0g，KH2PO40.

5、27g,Na2HPO4·12H2O2.58g,搅拌溶于1L双蒸水中，高压灭菌。（2）1.5MTris-HCl（pH8.8）：0.4gSDS与18.2gTris碱溶于100ml双蒸水中，用浓盐酸调节pH至8.8。（3）1.0MTris-HCl（pH6.8）：0.4gSDS与6.05gTris碱溶于100ml双蒸水中，用浓盐酸调节pH至6.8。（4）5×SDS-PAGE上样缓冲液：500mmol/L二硫苏糖醇（DTT），500mmol/LTris-HCl（pH6.8），0.5%溴酚蓝，10%SDS，50%甘油，用时按50ul/ml加入巯基乙醇。（5）5×Tris-甘氨

6、酸蛋白电泳缓冲液：94g甘氨酸与15.1gTris碱溶于950ml双蒸水中，再加入50ml10%的SDS贮存液。（6）30%丙烯酰胺：1gN,N’-亚甲双丙烯酰胺和29g丙烯酰胺溶于100ml双蒸水中，滤纸过滤两次。（7）10%过硫酸铵：1g过硫酸铵溶解于10ml双蒸水中，-20℃保存。（8）10%SDS贮存液（pH7.2）：10gSDS溶解于100ml双蒸水中，加热至68℃助溶，浓盐酸调节pH。（9）10×TBS（pH7.4）：KCl2g，Tris30g和NaCl80g溶解于1000ml双蒸水中，浓盐酸调节pH。（10）10×Transferbuffer（转膜缓

7、冲液）：58gTris，3.7gSDS和29g甘氨酸溶于800ml双蒸水中，用时稀释10倍加入200ml甲醇颠倒混匀。（11）TBST：将10×TBS稀释10倍后按1/2000的比例加入Tween-20混匀。（12）HBSS：8g/LNaCl,0.4g/LKCl,1g/L葡萄糖,60mg/LKH2PO4,47.5mg/LNa2HPO4,NaHCO30.35g/L，调pH至7.2，0.22μm滤膜过滤。（13）50×TAE缓冲液（1L）：0.5mmol/LEDTA（pH8.0），冰醋酸57.1ml，Tris碱242g，加双蒸水100ml溶解后定容至1L，密闭保存，电

8、泳时稀释1