饥饿环境下lewis细胞分泌的hmgb1对细胞自噬调节作用的研究

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1、分类号墅窆2：!!UDC612密级公珏编号!Q2窆窆S114030@江荨大擎硕士学位论文MASTER’SDISSERTATIoN论文题目纽熊骚境王曼星堕i墨细胞盆鲨的趔鱼旦!过细胞自咝遢苴佐趣笪硒宜专业名称!逝废捡验趁逝堂作者姓名一一．汪江指导教师迕丝遗熬援论文答辩日期2Q!垒生鱼月!!目2014年6月分类号392．11UDC612硕士学位论文编号10299S1l14030饥饿环境下Lewis细胞分泌的HMGBl对细胞自噬调节作用的研究STUDYoNTHEREGULATORYROLEoFHIGH．MOBILITYGROUPPROTEINB1(HMGBl)SECRETEDBYSTARVA

2、TIoN．TREATEDLEWISCELLSINAUTOPHAGY作者姓名：汪汀指导教师：许化溪教授小组成员：王胜军教授苏兆亮副教授申请学位：硕士学科专业：临床检验诊断学论文答辩日期：2014年6月11日学位授予单位：江苏大学学位授予日期：2014年6月16日答辩委员会主席：姚垫教授独创性声明本人郑重声明：所呈交的学位论文，是本人在导师的指导下，独立进行研究工作所取得的成果。除文中已注明引用的内容以外，本论文不包含任何其他个人或集体己经发表或撰写过的作品成果，也不包含为获得江苏大学或其他教育机构的学位或证书而使用过的材料。对本文的研究做出重要贡献的个人和集体，均已在文中以明确方式标明。

3、本人完全意识到本声明的法律结果由本人承担。学位论文作者签名：7祝1签字日期：工训中年6月叮日学位论文版权使用授权书本学位论文作者完伞了解学校有关保留、使用学位沦文的规定，同意学校保留并向国家有关部1、J或机构送交论文的复印件和电子版，允许论文被查阅和借阅。本人授权江苏大学可以将本学位论文的全部内容或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩I=

4、J或扫描等复制手段保存和汇编本学位论文。本学位论文属于保密口，在年解密后适用本授权书。不保密团。学位论文作者签名：≯钉／指导教师签名：MP年Ⅷ7日街政【智山严年‘月l户江苏大学硕士学位论文目的：摘要高迁移率组蛋白B1(highmobili

5、tygroupproteinB1，HMGBl)是一种染色质相关的核蛋白，也是一种炎症因子，可参与细胞自噬进程的调节作用。自噬是肿瘤细胞抵抗缺氧、化学药物、营养物质缺乏等应激条件的一种生存途径。本研究以小鼠肺癌细胞Lewis细胞系为研究对象，探讨在饥饿状态下小鼠Lewis细胞HMGBl表达及分泌情况；分析应激条件下分泌的HMGBl对小鼠Lewis细胞自噬的调控作用以及其可能依赖的分子机制。方法：(1)饥饿处理的Lewis细胞HMGBl表达及定位的检测：HBSS替换完全培养液0h、3h、6h、9h后WestemBlot、免疫荧光分别检测培养上清及Lewis细胞中HMGBl水平的变化：将HB

6、SS处理后的Lewis细胞进行核浆分离，WesternBlot分别检测细胞核与细胞质中HMGB1的表达水平。(2)饥饿及外源性重组HMGBl处理的Lewis细胞自噬水平检测：HBSS和重组HMGBlfl}tg／m1)分别处理细胞后，通过免疫荧光及WesternBlot测定细胞中LC3．IFLC3．II、p62和Beclin．1等自噬相关分子的表达情况。(3)siRNA干扰HMGBl表达及EP抑制HMGBl分泌后细胞自噬水平的检测：用Lipofectamine2000将HMGBl特异性siRNA转入Lewis细胞，培养48h后，免疫荧光检测LC3的表达；EP抑制HMGBl分泌，并用HBS

7、S处理细胞后WesternBlot检测LC3水平。(4)Lewis细胞HMGBl受体的检测及其相关分子机制的研究：HBSS处理Lewis细胞4h后PCR检测TLR2、TLR4、RAGE的表达；分别用HBSS处理细胞0h、3h、6h、9h，WesternBlot检测p-ErkI／2、NF．KB及Beclin．1的表达水平，并用RAGE特异性抗体或Erk抑制剂处理后检测细胞自噬7k平。饥饿环境下Lewis细胞分泌的l-IIdGBl对细胞自噬调节作用的研究结果：(1)HMGBl的表达随HBSS处理时间延长而增加；HBSS处理后核浆分离的Lewis细胞核中HMGBl减少，而细胞质中HMGBl增

8、加，且在细胞培养上清中检测到HMGBl，说明在饥饿状态下HMGBl有从核到胞浆的迁移，并最终分泌到细胞外。(2)饥饿处理后细胞中自噬标志性分子LC3．II及促自噬分子Beclin—l表达增加，泛素化蛋白p62减少：重组HMGBI(I“g／m1)N激细胞后，LC3一II的表达增加。(3)siRNA降低HMGBl表达或EP抑制HMGBl分泌后，自噬相关分子LC3表达减少。(4)在Lewis细胞中检测到HMGBl受体RAGE、TLR2、TLR4的表达