抑制自噬对内皮祖细胞促进静脉血栓机化再通的影响的实验研究

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1、硕士学位论文论文题目抑制自噬对内皮祖细胞促进静脉血栓机化再通的影响的实验研究研究生姓名尚斌指导教师姓名李晓强教授专业名称外科学研究方向深静脉血栓形成论文提交日期2013年4月抑制自噬对内皮祖细胞促进静脉血栓机化再通的影响的实验研究中文摘要抑制自噬对内皮祖细胞促进静脉血栓机化再通的影响的实验研究中文摘要目的：研究特定浓度的3-甲基腺嘌呤（3-methlyadenine，3-MA）作用后的血管内皮祖细胞（Endothelialprogenitorcells,EPCs）对于促进大鼠静脉血栓再通的影响，为临床治疗肢体深静脉血栓形成（Deep

2、veinthrombosis）提供一种全新有效的思路和实验依据。方法：1.Ficoll密度梯度离心法获取SD（Sprague-Dawley）大鼠(80-100g)的骨髓单个核细胞（bonemarrow-derivedmononuclearcells，BMMNCs），内皮祖细胞培养基（EGM-2MV）体外诱导分化为EPCs并进行鉴定。2.将60只SD（Sprague-Dawley）大鼠(250-300g)分成四组，每组15只，对大鼠下腔静脉采用近端丝线结扎法加远端三氯化铁腐蚀法，成功制作下腔静脉血栓模型；动物下腔静脉血栓模型做好后，每

3、组动物模型自一侧股静脉注射药物或细胞：A组：15只，空白对照组，注射生理盐水；B6组：15只，注射移植EPCs1ml(含细胞1×10）；C组：15只，注射3-MA1ml（浓度为5mmol/l）；D组：15只，注射经浓度为5mmol/l3-MA处理的EPCs；在不同时间点处死动物并取出动物血栓标本，送苏木精—伊红染色(HE染色)，高倍显微镜下计数超薄标本切片血栓再通的毛细血管密度，观察不同药物及种子细胞对静脉血栓机化再通的作用；对不同时间点处死的动物血栓标本行Westernblot法检测VEGF、bFGF、Ang-1、MCP-1四种促

4、进血栓机化与再通的细胞因子的蛋白表达。采用SPSS17.0统计软件进行分析，P<0.05，差异有统计学意义。结果：1.新分离的骨髓单个核细胞(BMMNCs)呈圆形，大小不一，第3天左右大部分细胞开始贴壁，形态有梭形、三角形、纺锤形或不规则形，第5-8天左右出现细胞集落和细胞线状排列，第8-12天接近融合，呈典型鹅卵石样外观。贴壁细胞的CD34、VEGFR、vWF、CD133均表达阳性。说明体外诱导培养的细胞是血管内皮祖细胞（Endothelialprogenitorcells,EPCs）。2.在400倍光学显微镜下各时间点血栓标本切

5、片I中文摘要抑制自噬对内皮祖细胞促进静脉血栓机化再通的影响的实验研究内可见血栓干燥收缩或部分溶解而出现裂隙，新生的血管内皮细胞长入并被覆于裂隙表面形成新的管腔样结构，经大鼠股静脉注射使用0.5ml浓度为5mmol/l的3-MA处理后的EPCs组动物模型血栓标本可见大量管腔样结构的纵切面及横切面，管腔内可见数量不等的红细胞；血栓标本石蜡切片HE染色显示在建模10天后的第7、14、28天形成的管腔样结构多于建模10天后的第0天；本组各时间点血栓标本石蜡切片HE染色均显示毛细血管形成密度比B组（注射移植EPCs组）、A组（注射生理盐水组）

6、及C组（注射3-MA组）为多，有统计学意义（P<0.05）；注射浓度为5mmol/l3-MA处理的EPCs的血栓模型标本中，VEGF、bFGF、Ang-1、MCP-1四种促进血栓机化与再通的细胞因子蛋白表达量明显高于其他组，有统计学意义（P<0.05）。结论：少量浓度为5mmol/l的自噬抑制剂3-MA（3-甲基腺嘌呤）可提高EPCs在血栓内部的存活率，提高血栓内部毛细血管密度；并可刺激VEGF、bFGF、Ang-1、MCP-1四种促进血栓机化与再通的细胞因子的释放。适当抑制自噬可促进血栓局部EPCs的增殖，减少其凋亡，进而能促进血

7、栓内部毛细血管生成，促进血栓的机化与再通。关键词：自噬；3-甲基腺嘌呤；血管内皮祖细胞；静脉血栓本课题受国家自然科学基金资助（30972941）作者：尚斌指导教师：李晓强教授II抑制自噬对内皮祖细胞促进静脉血栓机化再通的影响的实验研究英文摘要AutophagyExperimentalstudyofendothelialprogenitorcellspromotetheveinthrombosismachinerecanalizationAbstractObjective:Studyspecificconcentrationof3-M

8、A(3-methlyadenine,3-MA)theroleofendothelialprogenitorcells(Endothelialprogenitorcells,EPCs)forthepromotionofvenousthr