雷帕霉素对内皮祖细胞的影响的实验研究

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1、雷帕霉素对内皮祖细胞的影响的实验研究111[11Illl1111111IIlY1732424中文摘要目的：体外诱导分化内皮祖细胞(endothelialprogenitorcells，EPCs)，然后应用自噬激活剂雷帕霉素干预，探讨干预后的EPCs生物学特性的变化，为下肢深静脉血栓等疾病的治疗提供一种新的思路和实验依据。方法：1．密度梯度离心法获取Wistar大鼠的骨髓单个核细胞(bonemarrow-derivedmononuclearcells，BMMNCs)，内皮祖细胞培养基(EGM一2Mv)体外诱导分化为EPCs，然后将贴壁细胞随机分成5组，一组为对照组(正常培养组)，其余4组分别加入

2、含雷帕霉素O．01、O．1、1、lOug／L的EGM-2MV培养基中，各组分别培养24、48h。。2．MTT比色法观察其增殖能力。3．单丹(磺)酰戊二胺(泐c)染色法检测自噬囊泡．4．透射电镜观察雷帕霉素对EPCs细胞超微结构的影响5．Westernblot检测LC3一II蛋白表达的变化6．流式细胞仪检测细胞凋亡情况和周期进程。采用SPSSl7．0软件进行分析。结果：1、EGM-2MV培养基培养经Ficoll法分离的骨髓单个核细胞可以诱导生成EPCs；2．经雷帕霉素作用后测定的0D值呈明显降低的趋势，对照组明显高于干预组(尺0．05)。3．MDC成功对自噬囊泡染色，可以比较直观的观察到自噬囊泡

3、的存在与荧光强度随着随着时间的延长和浓度的增加而增强。4．透射电镜下见线粒体肿胀、自噬小体的双层膜结构、染色质边集等细胞超微结构的变化。5．雷帕霉素作用细胞后LC3-II蛋白的表达明显升高的趋势，干预组明显高于对照组(尺O．05)6．观察到了细胞凋亡呈现随着时间和浓度的增加而增加的趋势；药物使得细胞的增殖被阻滞在了G1／GO期和S期，因此进入到G2／M期的进行有丝分裂的细胞明显呈现下降的趋势。结论：雷帕霉素可以明显影响细胞周期进程，抑制细胞的增殖，促进细胞的凋亡和自噬的发生。关键词：雷帕霉素内皮祖细胞自噬激活凋亡细胞周期作者：刘辉’指导教授：李晓强AbstractTheeffectofrapa

4、mycinonendothelialprogenitorcellsTheeffectofrapamycinonendothelialprogenitorcellsObjective：Invitro，weinducedifferentiationofendothelialprogenitorcells(endothelialprogenitorcells，EPCs)，andthenapplytheactivatorofautophagy-rapamycintointerventtoexplorethebiologicalcharacteristicsofEPCsafterintervention

5、，forsuchasdeepveinthrombosistreatmenttoprovidnewideasandexperiments．Method：I．DensitygradientcentrifugationWistarratbonemarrowmononuclearcells(bonemarrow-derivedmononuclearcells，BMMNCs)，endothelialprogenitorcellmedium(EGM一2MV)inducedtodifferentiateintoEPCs，andthenadherentcellsweredividedintofivegroup

6、s，oneforthecontrolgroup(normalculturegroup)，andtheremaining4groupswereaddedwithrapamycinO．01，0．1，1，10腭／LofEGM一2MVmediumineachgroup，culturedfor24，48h．2．observetheproliferationassaybyMTT．3．monodansylcadaverine(MDC)stainingfordetectionofautophagicvesicles．4．EPCstransmissionelectronmicroscopetoviewultra

7、structure．5．WesternblotdetectionofLC3proteinexpression．6．flowcytometryforcellcycleprogressionandapoptosis．SPSS17．0softwareusedforanalysis．Results：1，EGM-2MVculturemediumisolatedbyFicollbonemarrowmononu