雷帕霉素对大鼠内皮祖细胞增殖、凋亡和no分泌的影

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1、雷帕霉素对大鼠内皮祖细胞增殖、凋亡和NO分泌的影【摘要】目的:观察雷帕霉素对大鼠骨髓内皮祖细胞(EPC)增殖、凋亡及一氧化氮(NO)分泌的影响.方法:密度梯度离心法获得SD雄性大鼠的骨髓EPCs,无菌条件下培养6d;实验分为5组:对照组及不同浓度(0.1,1.0,10,100μg/L)雷帕霉素组.各组皆于24h后收集标本,MTT法检测细胞增殖能力,流式细胞仪检测细胞凋亡率,硝酸还原酶法检测培养液中的NO含量.结果:与对照组相比,1.0~100μg/L的雷帕霉素可抑制EPCs增殖及NO分泌,并诱导EPCs凋亡(P<0.05),具有浓度依赖性.结论:1.0~1

2、00μg/L的雷帕霉素可抑制EPCs的增殖及NO分泌,并诱导EPCs凋亡.【关键词】雷帕霉素内皮祖细胞细胞增殖凋亡一氧化氮  0引言  近年来经皮腔内冠状动脉介入治疗(percutaneouscoronaryintervention,PCI)广泛用于冠心病的非药物治疗,但较高的再狭窄率(达20%~30%)严重影响手术疗效.研究发现,内皮损伤及功能失调是再狭窄发生的启动因素,促进内皮恢复已成为预防PCI术后再狭窄的新策略[1].内皮祖细胞(endothelialprogenitorcell,EPC)是一种起源于骨髓的原始细胞,以CD133,CD34,VEGFR2

3、等为标志,具有内皮系分化潜能,在一定条件下可定向分化为成熟的内皮细胞,参与损伤血管内皮的修复,并可以促进支架内皮化,对预防PCI后再狭窄具有重要意义[2].近来有研究发现,一定浓度的雷帕霉素可抑制EPC的分化、增殖及迁移,降低EPC内皮一氧化氮合酶mRNA的表达[3-5].拟观察雷帕霉素对EPC增殖、凋亡及NO分泌能力的影响,旨在为药物洗脱支架的内皮化延迟提供实验依据.  1材料和方法  1.1材料雄性SD大鼠,体质量(100±5)g,由第四军医大学实验动物中心提供.试剂和材料:Ficoll淋巴细胞分离液购自中国医学科学院生物工程医学研究所,胎牛血清为Hyclo

4、ne产品;M199为Gibco产品,血管内皮生长因子(VEGF)及碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)为美国CYTOLAB产品,雷帕霉素购自福建科瑞药业有限公司,NO试剂盒购自南京建成生物工程研究所,DiIacLDL为美国invitrogen公司产品,FITCUEAI为美国Sigma产品;ApoAlertTMAnnexinV凋亡检测试剂盒为美国Clontech公司产品.仪器有:荧光显微镜(Leica),倒置相差显微镜(Olympus),离心机(Sorvall),酶联免疫检测仪(美国BioRAD公司),EliteESP型流式细胞仪(美国COULTER公司)

5、,UV22450分光光度计(日本SHIMADZU公司).  1.2方法  1.2.1大鼠骨髓EPC的分离颈椎脱臼法处死大鼠,无菌条件下取出四肢长骨,750mL/L酒精内浸泡5min,用含肝素的培养液冲洗骨髓腔,收集细胞悬液,以1∶2的比例叠加到Ficoll淋巴细胞分离液上,保持液面清晰,离心(2000r/min)20min,小心吸取中间云雾状单核细胞层,5倍体积M199重悬,离心(1500r/min)10min,洗涤两次后弃上清,用含胎牛血清(100mL/L),VEGF(10μg/L)及bFGF(10μg/L)的M199重悬细胞,调整浓度为4×108/L,接种于

6、培养瓶中,取4h未贴壁的细胞,在37℃,50mL/LCO2条件下培养.  1.2.2EPC的表型鉴定将培养6d的细胞与DiIacLDL(2.4μg/mL)37℃下孵育1h,然后用40g/L多聚甲醛固定10min.PBS液浸洗后将FITCUEAI(10μg/mL)加于上述标本,37℃下孵育1h.用荧光显微镜进行鉴定,DiIacLDL和FITCUEAI染色双阳性细胞为正在分化的EPCs.  1.2.3实验分组细胞培养6d后,用2.5g/L胰蛋白酶、0.2g/L乙二胺四乙酸消化,全培养液重悬呈单细胞悬液后,分别接种于96孔培养板(以1.5×104细胞/

7、孔的密度)及培养瓶(以5×105细胞/瓶的密度).实验分为5组:对照组(仅加入全培养液)及不同浓度雷帕霉素(0.1,1.0,10,100μg/L)组.各组皆于24h后收集标本.  1.2.4MTT比色法检测细胞增殖96孔培养板收集的各组标本,每孔加浓度为5g/L的MTT溶液20μL,在37℃,50mL/LCO2孵箱中继续孵育4h;终止培养,吸弃上清液,每孔加入150μL的DMSO,振荡10min,在酶联免疫检测仪上490nm波长处测定各孔吸光度(A490),用只加培养液不加细胞的空白孔调零.  1.2.5流式细胞仪双标法检测细胞凋亡率各组细胞用0.01mol/L

8、PBS冲洗,1.25g/

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