低频脉冲电磁场对大鼠骨髓源性内皮祖细胞增殖活性和no分泌的影响

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1、低频脉冲电磁场对大鼠骨髓源性内皮祖细胞增殖活性和NO分泌的影响作者：马彦卓，许旭东，韩凯，李飞，曹艳杰，张荣庆,王海昌【摘要】目的：观察不同作用时间下低频脉冲电磁场对大鼠骨髓源性内皮祖细胞（EPCs）增殖活性和NO分泌的影响.方法：密度梯度离心法获取大鼠骨髓单个核细胞,培养4d后收集贴壁细胞，每日给予低频脉冲电磁场干预，磁场强度0.6mT，频率15Hz.按作用时间的不同分为对照组（0h）和磁场作用时间组(0.5，2，4，8h组)，各组细胞培养及磁场干预3d后,分别采用MTT比色法测定EPCs的增殖活性,流式细胞仪检测细胞周期，Griess法检测培养上清中NO水平.结

2、果：对照组A490nm为（0.37±0.07）,0.5h组（0.37±0.06）,2h组（0.40±0.09）与对照组（0.37±0.07）相比差异无统计学意义(P>0.05）；4h组A490nm值开始增加［(0.45±0.03）vs（0.37±0.07）;P<0.05］,8h组较对照组增加最为明显［（0.49±0.08）vs（0.37±0.07）；P<0.01］.0.5h组，2h组细胞增殖指数PI（S+G2M）％与对照组相比差异无统计学意义(P>0.05），4h组，8h组细胞增殖指数与对照组相比差异均有统计学意义（P<0.05）.NO

3、分泌随磁场作用时间的延长，其分泌增加.结论：低频脉冲电磁场可影响EPCs的增殖及NO分泌，随着作用时间的延长，细胞增殖及NO分泌增加.【关键词】电磁场;内皮祖细胞;细胞增殖；一氧化氮　　0引言　　内皮祖细胞(endothelialprogenitorcells，EPCs)作为治疗性血管形成的研究靶点，已发现其不仅参与血管形成，也参与出生后血管生成［1］.低频脉冲电磁场作为一种外来干预手段，已发现其可促进内皮细胞修复，促进内皮细胞FGF的分泌，提示低频电磁场对血管形成具有促进作用［2］.我们采用体外培养大鼠骨髓EPCs,观察低频脉冲电磁场不同作用时间下骨髓EPCs增殖

4、能力和NO分泌的变化及其时效关系,并探讨其相关作用机制，以期寻找一种新的促进血管生成的手段.　　1材料和方法　　1.1材料健康雄性SD大鼠30只，体质量80～100g（第四军医大学实验动物中心）；脉冲电磁场发生仪（第四军医大学生物医学工程系）；Ficoll淋巴细胞分离液（中国医学科学院生物工程医学研究所）；胎牛血清（美国Hyclone公司）；血管内皮生长因子(VEGF)，成纤维细胞生长因子（bFGF）（澳大利亚CYTOLAB公司）；FITC标记荆豆凝集素Ⅰ(FITCUEAI，美国Sigma公司）；DiI标记的乙酰化低密度脂蛋白(DiIacLDL，美国Molec

5、ularProbe公司）；NO试剂盒（南京建成生物工程研究所）；激光共聚焦显微镜（美国BioRad公司）.　　1.2方法　　1.2.1EPCs的分离、培养与鉴定［2-3］将大鼠颈椎脱臼处死后,取四肢骨用750mL/L乙醇浸泡10min，用5mL注射器抽取培养液冲洗骨髓液,密度梯度离心法获取单个核细胞,将其接种予培养瓶中,在M199培养基(含100mL/LFBS，VEGF10μg/L，bFGF5μg/L，L谷氨酰胺300mg/L，青霉素1×105U/L，链霉素100mg/L，肝素1.25×104U/L)中培养,差异贴壁法培养4h后，吸取上清置于新的培养瓶中继续培养

6、4d.将培养4d的细胞消化，接种于盖玻片上，24h后将细胞爬片行DilacLDL与FITCUEAI直接免疫荧光双染.向细胞爬片孔内加10mg/LDilacLDL，37℃孵育10h后，细胞爬片经40g/L多聚甲醛室温固定10min，PBS漂洗后加入10mg/LFITCUEAI并于37℃避光孵育1h，PBS洗涤同上，晾干后封片，激光共聚焦显微镜观察.FITCUEA和DiIacLDL双染色阳性细胞为正在分化的EPCs.　　1.2.2实验分组PEMFs发生仪频率15Hz,磁感应强度:0～1.4mT可调，线圈直径200mm.调整两线圈距离至100mm.将

7、线圈放置在孵箱中,刺激时将细胞放置在两线圈中间位置.调整需要的强度和频率,实验分组按磁场强度分为对照组（不加磁场干预），0.2mT,0.6mT和1.0mT各组,贴壁细胞消化后,每组按每日干预时间的不同随机分成0.5，2，4，8h各亚组.即每日各组分别干预0.5，2，4和8h，共3d.　　1.2.3细胞活性检测如上述方法收集贴壁细胞并计数.将等量EPCs接种到96孔培养板上,磁场干预3d后，每孔加5g/LMTT20μL,培养4h后小心吸弃上清液,每孔加入DMSO150μL,于微量振荡器充分振荡10min,使结晶充分溶解,在酶联免疫检测仪上测A490nm,以空白培养