脉冲电磁场对大鼠骨髓间充质干细胞增殖及成骨分化的影响

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1、脉冲电磁场对大鼠骨髓间充质干细胞增殖及成骨分化的影响【摘要】目的：探讨脉冲电磁场（PEMFs)对大鼠骨髓间充质干细胞（rMSCs）的影响.方法：用全骨髓贴壁法分离rMSCs，对其进行1Hz和15Hz的PEMFs刺激，MTT法测定细胞增殖水平，检测碱性磷酸酶活性，进行四环素荧光染色和钙结节染色.结果：rMSCs经PEMFs刺激后，各实验组细胞增殖水平均有不同程度提高，差异具有统计学意义（P<0.05），其中1Hz，0.4mT组改变最为明显（3d，0.323±0.051；5d，0.714±0.058），对照组（3d，0.246±0.044；5d，0.487±

2、0.064），差异具有统计学意义（P<0.01）；碱性磷酸酶检测实验组水平升高（5d，0.348±0.032；15d，2.339±0.034），对照组（5d，0.205±0.026；15d，0.533±0.013），差异具有统计学意义（P<0.05），四环素荧光染色和钙结节染色结果均呈阳性.结论：rMSCs经PEMFs刺激后，能促进体外培养rMSCs的增殖水平及成骨分化，磁场参数对实验结果有影响.【关键词】脉冲电磁场；骨髓间充质干细胞；增殖；成骨细胞　　0引言　　骨髓间充质干细胞（mesenchymalstemcells，MSCs）存在于骨髓基质系

3、统中，具有自我更新能力和多向分化潜能，免疫原性弱［1-3］.脉冲电磁场（pulsedelectromagicfields，PEMFs)能够促进活细胞增殖及分化，刺激骨局部因子的产生，改善骨密度和生物力学特性［4］，用于骨折延迟愈合、骨不连、骨质疏松症等骨科疾病［5］.近年来，国内学者在这方面开始了大量研究工作，认为MSCs经12Hz，1.1mT的PEMFs合理刺激后，细胞增殖加速，符合成骨细胞的形态特征和生物学特性［6］.利用恒磁场作用于骨组织中细胞，发现恒磁场处理可以促进MSCs向成骨方向分化［7］.本实验通过观察rMSCs在低频率PEMFs的作用下增殖水平

4、变化和细胞分化情况，以了解不同参数的PEMFs对rMSCs产生的影响.　　1材料和方法　　1.1材料　　SD仔鼠，12～15d，体质量30～35g，第四军医大学实验动物中心提供.骨愈合刺激仪（第四军医大学生物医学工程系研制，ZL.0224739.4），治疗频率为15Hz和1Hz.低糖DMEM（美国Hyclone公司）；胎牛血清（天津灏洋生物制品科技有限责任公司）；胰蛋白酶，茜素红S（美国Sigma公司）；盐酸四环素胶囊（西安利君制药股份有限公司）；碱性磷酸酶试剂盒（中生北控生物科技股份有限公司）.　　1.2方法　　1.2.1rMSC的体外分离培养　　断颈处死大

5、鼠，无菌条件下取其股骨和肱骨.在PBS中将骨剪成1～2mm3的小块，100目筛网过滤后移入离心管中，1200rpm离心5min，弃上清，重悬浮于4mL低糖DMEM中.72h后换液.　　1.2.2rMSCs生物学特性鉴定　　进行PAS过碘酸雪夫氏染色、油红O染色和碱性磷酸酶（ALP）染色.　　1.2.3rMSCs生长曲线的绘制　　将原代细胞以5×106cells/孔接种在24孔板上，第4日开始，每日消化3个孔，分别计数，求平均值绘制生长曲线.将第3代细胞以1×104cells/孔接种在24孔板上，第2日开始以同上方法绘制生长曲线.　　1.2.4刺激方法　　P

6、EMFs发生仪频率：15Hz，1Hz；磁感应强度：0～0.8mT可调；线圈直径：200mm.调整两线圈距离至100mm.将线圈放置在孵箱中，刺激时将细胞放置在两线圈中间位置.调整需要的强度和频率，刺激结束后，将对照组放在同样位置相同时间.刺激时间为每次3h，1次/d.　　1.2.5MTT法检测　　细胞增殖将rMSCs以1×104cells/mL接种于7个96孔板中，每板接种32孔.刺激方式为：T0组(对照组)；T1组(15Hz，0.2mT)；T2组(15Hz，0.4mT)；T3组(15Hz，0.8mT)；T4组(1Hz，0.2mT)；T5组(1Hz，0.4mT

7、)；T6组(1Hz，0.8mT)，连续作用5d.接种第2日开始PEMFs作用.第3日每板选择16孔，加MTT（5g/L）20μL，37℃孵育4h，弃上清，加入DMSO150μL，振荡10min，测定490nm波长时各孔的吸光度A值.第5日对其余孔做同样检测.　　1.2.6ALP活性检测　　将rMSCs以每孔1×104cells/mL接种于6个24孔板中，每板接种8孔，分为2组，每组3个板.刺激方式为：T0组(对照组)，T1组(1Hz，0.4mT).接种第2日开始PEMFs刺激，连续刺激15d.第3日选两个板，测定ALP活性.第5日和第15日各检测2个板.　　1

8、.2.7四环素荧光标记　　将rMSCs