酒精对兔骨髓间充质干细胞成骨分化的影响研究

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1、cultivation，exact，cellmodelcanprovideanidealexperimentalstudyofbonetissueengineeringforwardthe．Keywords：bonemarrowmesenchymalstemcells；osteoblast；cellculture4引言特发性股骨头缺血性坏死(IFHN)主要包括激素性和酒精性的股骨头坏死。IF}玎N是一种常见致残性疾病，发病率较高，近年来呈逐渐上升趋势。如早期不能得到及时有效的治疗，80％以上的患者将最终导致坏死性骨关节病，甚至致残。股骨头缺血性坏死仍是医学界的一大难题，

2、了解IFHN的发病机制，对探索该病有效的预防、早期诊断和治疗方法有重要的临床意义。酒精性股骨头缺血性坏死致残率极高，常累及中青年，呈进展性和致残性发展，如早期不能得到及时有效的治疗，80％以上的患者将在4年内发生股骨头塌陷，关节间隙变窄，最终导致坏死性骨关节炎，病人髋关节功能障碍而致残不得不行人工髋节置换。长期过量饮酒是股骨头缺血坏死的高危因素。日本学者研究发现，大量饮酒发生ONFH的几率大大增高，并和饮酒的计量存在明显相关性，一个星期内饮酒量小于400ml的相对危险系数为3．3、400．1000ml之间的相对危险系数为9．8、大于1000ml的相对危险系数为17．9。

3、此后我国进行了全国多中心大样本病例对照试验发现，饮酒量与发生ONFH存在明显相关性，其中偶尔、经常饮酒者发生股骨头缺血性坏死的的相对危险系数分别是3．2、13．1。每周饮酒量小于3209的相对危险系数为2．8、320—7999的为9．4、8009以上是14．8。酒精性股骨头坏死发病机制仍不清楚。长期大量饮酒可引起股骨头髓内成骨细胞功能发生改变，使成骨细胞凋亡，相关基因表达水平发生变化。但其机制尚不清楚，国内外类似研究报道较为匮乏。本研究采用大兔细胞体外培养，分析观察充质干细胞(BMSCs)在体外培养状态下的生长情况，运用Percoll分离液，利用密度梯度离心法联合差速贴

4、壁法分离、纯化骨髓BMSCs并对常规培养及成骨诱导培养方法进行对比分析，并研究观察酒精对体外培养成骨细胞凋亡的影响。为研究骨折骨病治疗的基础实验研究建立理想的细胞模型提供较好的细胞模型。正文本研究于2012．01／2012．12在广西大学生命科学实验中心实验室完成。选用健康2月龄新西兰大白兔1只，体质量2．0．2．5kg，由广西中医药大学动物实验中心提供，许可证号：scxK(桂)2012．002。实验过程中对动物的处置符合2006年科技部《关于善待实验动物的指导性意见》的规定【31。l材料和方法1．1实验仪器：洁净工作台苏州安泰(SW-CJ—IFD)低速离心机上海安亭(

5、TDL．80．2B)倒置光学显微镜日本(OPTEC，BDS200)细胞恒温培养箱美匡](HERACELL150i)水平摇床北京六一。(WD-9405B)实验试剂：胎牛血清(Hyclone公司，Cat．No．SI-130087．01)DMEM．高糖培养基(Hyelone公司，Cat．No．SH30023．01B)DⅧM．低糖培养基(Hyelone公司，Cat．No．SH30021．01B)DMEM-F12培养基(Hyclone公司，Cat．No．SH30023．01B)199基础培养基(Hyclone公司，Cat．No．SH30253．01B)青链霉素(北京碧云天公司)胶

6、原酶I型(美国sigma公司，9001—12-1．SC013001)乙醇(美国sigma公司，79—14一1．S12473701)胰蛋白酶(北京碧云天公司)D-Hanks液、TE酶中国华美公司PBS磷酸钾缓冲液中国华美公司61．2方法1．2．1细胞培养取用新西兰大白兔(2．0．2．5kg)，无菌下取双侧股骨头髓内脂肪组织，仔细去除肉眼可见的纤维和血管组织，用PBS洗涤去除血块。用眼科剪剪成O．5～lmm大小，加入胶原酶I(19／L)，37℃水浴振荡(100r／min)消"f)660—90min，直至形成乳糜样浓稠液体。将消化后的乳糜样液体加入4mlPBS，轻轻吹打混匀，

7、将细胞运用2501am大小尼龙网虑入离心管中，加入10mlFBS向离心管中冲洗细胞3次。运用每2509／min的转动速度离心5min，采用吸管吸出上清液，添入另外一根试管中，并注入PBSloml冲洗细胞，给予离心、除去上清液后反复此程序2次。再次运用含20％新生牛血清DMEM／F12细胞培养液10ml冲洗，重悬浮细胞，密度为2×105个／ml。用50p．1添加进每孔2ml的培养液6孔板中，盖上20mmx20mm的多聚赖氨酸清理过的消毒无菌盖玻片。置入5％C02饱和湿度培养箱中，37"C进行培养。换液的时间由细胞贴壁情况而定。逐日在倒置显微