酒精对人骨髓间充质干细胞成脂与成骨分化的影响

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1、授予单位代码：学号或申请号：1045903341361郑州大学硕士学位论文论文题目：酒精对人骨髓间充质干细胞成脂与成骨分化的影响作者姓名：学科门类：专业名称；导师姓名、职称：尹万乐医学骨外科王义生教授=零零六年五月郑州人学2006年硕士研究生毕业论文酒精对人骨髓问充质干细胞成脂与成骨分化的影响(摘要)酒精对人骨髓间充质干细胞成脂与成骨分化的影响研究生尹万乐导师王义生郑州大学第一附属医院骨外科河南郑州450052中文摘要目的与背景股骨头坏死(Osteonecrosisofthef鲫oralhead，oN

2、FH)是骨科常见疾病之一，激素和酒精中毒是非创伤性0NFH最常见病因。非创伤性oNFH导致患者髋部疼痛、髋关节功能障碍，多数病程难以逆转，尚无确切有效的治疗方法，预后差，致残率高，往往最终需要采取人工全髋关节置换术。国内外学者对0NFH进行了大量研究，提出了多种发病机制理论，但未能完全解释。随着骨髓间充质干细胞(bonemarrowmesenhymalstemcells，BMscs)研究的深入开展，发现BMSCs在不同条件下可以向成骨、成软骨和成脂肪系等不同方向分化。在骨组织损伤后修复中，BMSCs也

3、发挥了相当重要的作用。同时，股骨头和颈部缺乏骨膜结构使得股骨头部位缺乏骨膜内成骨，软骨成骨能力又相对较弱，从而使得BMSCs成骨在股骨头部位的成骨机制中占有更加重要的地位。王义生等报道，动物学实验研究证明，酒精中毒可导致股骨头内造血组织减少，脂肪细胞增殖肥大，骨细胞内脂质沉积而变性死亡。这些与酒精性oNFH的早期病理变化相一致。细胞分子生物学研究发现，酒精可诱导BMsCs大量成脂分化，面成骨分化受抑制。揭示了酒精性oNFH的新的发病机理。但是，目前采用人的骨髓间充质干细胞(humanbonemarro

4、wmesenhymalstemcells，hBMSCs)研究ONFH的报道尚少。为了进一步探讨人酒精性0NFH的发病机制，我们分离获取原代人骨髓间充质干细胞，经传代后，加入酒精进行体外培养，采用分子生物学方法，观察酒精对hBMScs的影响。材料和方法骨髓细胞来自郑州大学一附院临床志愿者。获取骨髓后，应用密度梯度离心法，按1：1体积比例将percoll(比重为1．0739／m1)离心液与稀释后的骨髓混郑州大学2006年硕士研究生毕业论文酒精对人骨髓问充质干细胞成腊与成骨分化的影响(摘要)合，在室温下离心

5、，可见到离心管中的液体分层，上层为脂肪、水层、杂质层，底层为部分血细胞及组织碎片。收集中间交界处白膜层的单个核细胞层。移至离心管中，加入DMEM培养液后继续离心两次，弃去上清液。采用DMEM培养基(含青霉素loo单位／ml，链霉素looug／m1，10％胎牛血清，维生素C50pg／ml，L谷氨酰胺1JIlM，Hepes20IIlM)吹打混匀后，计数，以6×106／cm2接种于培养瓶中。置37．00c含5％cO。的孵育箱中培养，获得hBMSCs。对原代hBMScs传一代后，随机分为两组，实验组加入酒精(

6、浓度为O．09M)，对照维不加酒精，继续培养细胞6天。采用逆转录聚合酶链式反应(Reversetranscription—polymerasechainreaction，RT—PcR)技术，检测细胞中成脂转录因子(adipogenictranscriptionfactor)PPARYmRNA和成骨基因Osteocalcin(骨钙素)mRNA的表达。结果1．通过密度梯度离心法，贴壁分离培养，本实验在体外培养得到hBMscs，经传代后得到第2代hBMScs。2．用酒精处理细胞后6天，采用RT—PcR技术检

7、测分析，显示实验组细胞中PPARYmRNA呈高表达，而对照组细胞中PPARY姝NA呈f氏表达，两组间差异有显著性(只o．05)。实验组细胞中OsteocalcinmRNA呈低表达，而对照组细胞中OsteocalcinmRNA呈高表达，两组问差异有高度显著性(尺0．01)。结论1．采用密度梯度离心法能够在体外分离和培养人骨髓间充质干细胞。2．O．09mol／L浓度酒精，可导致hBMscs中成脂转录因子PPARYmRNA高表达，同时导致hBMSCs中成骨基因OsteocalcinmRNA低表达。本实验结果

8、表明0NFH时股骨头骨髓内大量脂肪堆积与成骨减少，可能与酒精诱导人骨髓问充质干细胞成脂分化增多，成骨分化减少有关。关键词酒精人骨髓间充质干细胞逆转录一聚合酶链式反应成脂转录因子骨钙素Il郑州大学2006年硕士研究生毕业论文酒精对人骨髓间充质干细胞成脂与成骨分化的影响(摘要)EffectofAlcoholonHumanBoneMarrowMesenchymalStemCellsDiff．erentiatingintoAdipocytesandOsteobl