石斛多糖干预大鼠骨髓间充质干细胞成脂及成骨分化的研究

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1、硕士学位论文论文题目：石斛多糖干预大鼠骨髓间充质干细胞成脂及成骨分化的研究作者姓名徐路加指导教师华允芬学科专业药学所在学院药学院提交日期2015年4月M.S.ThesisStudyoftheeffectofdendrobiumpolysaccharidesonadipogenicdifferentiationandosteogenicdifferentiationofratbonemarrowmesenchymalstemcellsXuLujiaCollegeofPharmaceuticalSciencesZhejiangUniversity

2、ofTechnologyHangzhou,P.R.ChinaApril2015渐江工业大学学位论文原创性声明本人郑重靑明：所提交的学位论文是本人在导师的指导下，独立进行研究工作而取得的研究成果。除文中已加＾＾１标注引用的内容除外，本论文不包括其他个人或集体己经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得浙化工业大学或其它的教育机构的学位证书而使用过的相关材料。对本文的研究做出重要贡献的个人巧集体，均已在文中用明确方式标明。本人承担本声明的法律责任。＾作者签名；！ｆ卑＾月：系妥合如曰期；次／曰学位论文版权使用授权

3、书本学位论文的作者売全了解学校相关保留、使用学位论文的规定，同意学校保留并向国家相关部口或机构送交本论文的复印件及浙江工化大学可ｔｕ将本学位论文的全部或部分电子版，允许本论文被查阅和借阔。本人授权＾１＞、将部分内容编入有关的数据库进行检秦，可：采用影印缩印或巧描等复制方式保存和汇编本学位论文。本学位论文属子１、保密□，在年解密后患用本授权书。／２、不保密从‘’（请在上相应方框內打Ｖ）作者签名：游棘日期：＞＾戸年名月日／导师签名；日期Ｉｆ年＾月Ｉ日本课题的研究得到了浙江省自然科学基金项目（

4、LQ12C02003）的资助，特此表示感谢！石斛多糖干预大鼠骨髓间充质干细胞成脂及成骨分化的研究摘要近年来，天然药物逐渐引起了人们的重视，天然药物作为药物在临床上也得到了广泛应用。石斛是我国传统名贵中药，药效显著，应用历史悠久，其具有的诸多功效已在几千年的中医临床实践中得到验证。本论文主要研究了铁皮石斛（Dendrobiumofficinale）和铜皮石斛（Dendrobiummoniliforme）多糖对大鼠骨髓间充质干细胞（bonemesenchymalstemcells，BMSCs）成脂及成骨分化的影响，并尝试通过现代分子生物学理论来解

5、释石斛“滋阴补肾”的传统功效，为今后更好的利用中药石斛资源提供科学依据。本实验内容主要包括以下4个部分：1.采用常规的溶剂浸提法提取铁皮石斛多糖和铜皮石斛多糖，并通过乙醇沉淀，Sevage法除蛋白等一系列操作对石斛多糖进行初步分离纯化。所提取的铁皮石斛多糖得率为20.4%，铜皮石斛多糖得率为10.6%。浓硫酸-苯酚比色法测得本次实验中所提取的铁皮石斛和铜皮石斛粗多糖中多糖含量分别为76.4%、67.5%，表明所提取的石斛多糖具有比较高的纯度。2.采用全骨髓贴壁筛选法分离得到SD大鼠骨髓间充质干细胞（BMSCs），并进行传代培养，倒置显微镜下进

6、行细胞形态学观察，并采用流式细胞仪检测细胞表面特异性标志物的表达情况。台盼蓝拒染法检测细胞活力，噻唑蓝（MTT）比色法测定细胞生长曲线及不同石I斛多糖对BMSCs生存率的影响。结果表明：分离得到的大鼠BMSCs在显微镜下呈纺锤形、梭形、漩涡状生长，形态均一，细胞活力可达95%以上。流式细胞仪检测细胞表面标志物表达正常，基本不表达造血细胞标志物CD45，表达CD105。细胞生存率实验表明质量浓度为50～800μg/mL的铁皮石斛和铜皮石斛多糖对BMSCs的生存率无显著影响，表明在此浓度范围内石斛多糖对BMSCs无细胞毒性。3.诱导BMSCs成脂

7、分化，添加质量浓度为50～800μg/mL的铁皮石斛和铜皮石斛多糖分别进行干预，干预成脂分化10天、20天后，油红O染色并定量检测，实时荧光定量PCR检测过氧化物酶体增殖物激活受体γ（PPARG）、脂蛋白脂肪酶（LPL）、脂肪酸结合蛋白4（FABP4）的mRNA表达水平。实验结果：质量浓度为400、800μg/mL的铁皮石斛和铜皮石斛多糖均能显著降低油红O染色后的吸光值，下调PPARG、LPL、FABP4的mRNA表达。结果表明，在一定质量浓度下，两种石斛多糖可显著抑制BMSCs成脂分化。4.诱导BMSCs成骨分化，添加质量浓度为50～800

8、μg/mL的铁皮石斛和铜皮石斛多糖分别进行干预，干预成骨分化7天后，进行碱性磷酸酶（ALP）染色、诱导分化28天后，进行茜素红染色。用实时荧光定量PCR检测核心结合