脉冲电磁场对大鼠骨髓间充质干细胞增殖及成骨分化的

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1、脉冲电磁场对大鼠骨髓间充质干细胞增殖及成骨分化的【摘要】目的:探讨脉冲电磁场(PEMFs)对大鼠骨髓间充质干细胞(rMSCs)的影响.方法:用全骨髓贴壁法分离rMSCs,对其进行1Hz和15Hz的PEMFs刺激,MTT法测定细胞增殖水平,检测碱性磷酸酶活性,进行四环素荧光染色和钙结节染色.结果:rMSCs经PEMFs刺激后,各实验组细胞增殖水平均有不同程度提高,差异具有统计学意义(P<0.05),其中1Hz,0.4mT组改变最为明显(3d,0.323±0.051;5d,0.714±0.058),对照组(3d,0.246±0.044;5d,0.48

2、7±0.064),差异具有统计学意义(P<0.01);碱性磷酸酶检测实验组水平升高(5d,0.348±0.032;15d,2.339±0.034),对照组(5d,0.205±0.026;15d,0.533±0.013),差异具有统计学意义(P<0.05),四环素荧光染色和钙结节染色结果均呈阳性.结论:rMSCs经PEMFs刺激后,能促进体外培养rMSCs的增殖水平及成骨分化,磁场参数对实验结果有影响.【关键词】脉冲电磁场;骨髓间充质干细胞;增殖;成骨细胞  0引言  骨髓间充质干细胞(mesenchymalstemcells,MSCs)存在

3、于骨髓基质系统中,具有自我更新能力和多向分化潜能,免疫原性弱[1-3].脉冲电磁场(pulsedelectromagicfields,PEMFs)能够促进活细胞增殖及分化,刺激骨局部因子的产生,改善骨密度和生物力学特性[4],用于骨折延迟愈合、骨不连、骨质疏松症等骨科疾病[5].近年来,国内学者在这方面开始了大量研究工作,认为MSCs经12Hz,1.1mT的PEMFs合理刺激后,细胞增殖加速,符合成骨细胞的形态特征和生物学特性[6].利用恒磁场作用于骨组织中细胞,发现恒磁场处理可以促进MSCs向成骨方向分化[7].本实验通过观察rMSCs在低频率PEM

4、Fs的作用下增殖水平变化和细胞分化情况,以了解不同参数的PEMFs对rMSCs产生的影响.  1材料和方法  1.1材料  SD仔鼠,12~15d,体质量30~35g,第四军医大学实验动物中心提供.骨愈合刺激仪(第四军医大学生物医学工程系研制,ZL.0224739.4),治疗频率为15Hz和1Hz.低糖DMEM(美国Hyclone公司);胎牛血清(天津灏洋生物制品科技有限责任公司);胰蛋白酶,茜素红S(美国Sigma公司);盐酸四环素胶囊(西安利君制药股份有限公司);碱性磷酸酶试剂盒(中生北控生物科技股份有限公司).  1.2方法  1.2.1rMSC

5、的体外分离培养  断颈处死大鼠,无菌条件下取其股骨和肱骨.在PBS中将骨剪成1~2mm3的小块,100目筛网过滤后移入离心管中,1200rpm离心5min,弃上清,重悬浮于4mL低糖DMEM中.72h后换液.  1.2.2rMSCs生物学特性鉴定  进行PAS过碘酸雪夫氏染色、油红O染色和碱性磷酸酶(ALP)染色.  1.2.3rMSCs生长曲线的绘制  将原代细胞以5×106cells/孔接种在24孔板上,第4日开始,每日消化3个孔,分别计数,求平均值绘制生长曲线.将第3代细胞以1×104cells/孔接种在24孔板上,第2日开始以同上方法绘制生

6、长曲线.  1.2.4刺激方法  PEMFs发生仪频率:15Hz,1Hz;磁感应强度:0~0.8mT可调;线圈直径:200mm.调整两线圈距离至100mm.将线圈放置在孵箱中,刺激时将细胞放置在两线圈中间位置.调整需要的强度和频率,刺激结束后,将对照组放在同样位置相同时间.刺激时间为每次3h,1次/d.  1.2.5MTT法检测  细胞增殖将rMSCs以1×104cells/mL接种于7个96孔板中,每板接种32孔.刺激方式为:T0组(对照组);T1组(15Hz,0.2mT);T2组(15Hz,0.4mT);T3组(15Hz,0.8mT);T4组(1H

7、z,0.2mT);T5组(1Hz,0.4mT);T6组(1Hz,0.8mT),连续作用5d.接种第2日开始PEMFs作用.第3日每板选择16孔,加MTT(5g/L)20μL,37℃孵育4h,弃上清,加入DMSO150μL,振荡10min,测定490nm波长时各孔的吸光度A值.第5日对其余孔做同样检测.  1.2.6ALP活性检测  将rMSCs以每孔1×104cells/mL接种于6个24孔板中,每板接种8孔,分为2组,每组3个板.刺激方式为:T0组(对照组),T1组(1Hz,0.4mT).接种第2日开始PEMFs刺激,连续刺激15d.第3日选两个板,

8、测定ALP活性.第5日和第15日各检测2个板.  1.2.7四环素荧光标记  将rMSCs以3

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