盐酸戊乙奎醚通过抑制自噬减轻肢体缺血再灌注诱发小肠自噬的实验研究

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1、南方医科大学2011级博士学位论文盐酸戊乙奎醚通过抑制自噬减轻肢体缺血再灌注诱发小肠自噬的实验研究ProtectiVeefkctsofpenehyclldinehydrochlorideonautophagyinsmallintestinecausedbylimbischemiareperfIusioninjuryinrats课题来源：专业名称麻醉学学位申请人康于庆指导教师古妙宁答辩委员会主席徐世元答辩委员会成员黑子清余守章李雅兰曹铭辉论文评阅人2014年5月8日广州博士学位论文盐酸戊乙奎醚通过抑制自噬减轻肢体缺血再灌注诱发小肠自噬的实验

2、研究博士研究生：康于庆指导老师：古妙宁摘要研究背景sewell在1955年结扎狗冠状动脉时，发现恢复血流后组织器官损伤加重。缺血再灌注损伤被首次发现，在之后的大量动物实验中已得到证实。肢体缺血再灌注损伤(Limbischemiareperfusion叫u巧．LIⅪ)不仅可导致局部组织损伤，还可引起远隔脏器损伤，小肠缺血再灌注损伤还会因为细菌和毒素的释放，诱发全身炎症反应综合征(SIRS)，多器官功能障碍综合征(MODS)等。目前对小肠缺血再灌注损伤的研究大都与凋亡有关。以往认为坏死和凋亡是缺血再灌注所诱导的细胞死亡的主要方式。近年来，一种

3、新的程序性细胞死亡方式——自噬(Autophagy)，即II型程序性细胞死亡，越来越受到重视。适度的自噬是细胞完成自身代谢和细胞器更新的重要方式，对维持机体内环境稳定，以及调控细胞损伤和老化具有重要意义；而非生理性的、过度的自噬则会导致细胞过多死亡，从而引起组织器官产生病理性变化。自噬甚至可能影响细胞凋亡的发生，自噬在小肠缺血再灌注损伤的不同阶段扮演着不同角色，缺血期自噬轻度增加，具有一定的保护作用；但是在再灌注期自噬明显增加，反而加重小肠损伤。种种迹象表明，再灌注后小肠细胞白噬异常增多可能是导致小肠结构和功能损伤的重要启动因素之一。如果

4、能够早期、有效抑制自噬的发生，有望减轻小肠缺血再灌注损伤，甚至减少细胞凋亡的发生。盐酸戊乙奎醚注射液(长托宁)是我国自主研制的新型抗胆碱药，具有选择性Ml、M3和Nl、N2受体拮抗作用，对中枢和外周均有很强的抗胆碱中文摘要作用，而对M2受体无明显作用，可有效避免阿托品因缺乏M受体亚型选择性所致的心动过速与阻断突触前膜M2受体调节功能，且药效长而副作用较少。前期的研究表明，长托宁可抑制由缺血再灌注损伤诱发的小肠细胞凋亡，但长托宁对小肠细胞自噬的影响研究文献报道较少。研究目的本实验以肢体缺血再灌注损伤大鼠小肠为实验研究和观察对象，建立肢体缺血

5、再灌注模型，以长托宁进行干预，观察各组LDH释放量。从而评价各组小肠组织和细胞的受损程度；荧光染色、并通过RT．PcR和westem-blot方法检测小肠组织的自噬相关基因(autophagy—relatedgene，Atg)的mRNA和蛋白表达水平，从细胞和分子水平探讨长托宁对肢体缺血再灌注损伤中小肠细胞自噬的影响，为临床围手术期小肠保护提供新的理论基础和可能的治疗方法。研究方法和结果本实验主要分为二个部分，主要方法和结果如下：一．大鼠肢体缺血再灌注损伤诱发小肠自噬的研究l、实验分组：成年雄性SD大鼠48只，随机分为2组，假手术组(s组

6、)，缺血再灌注组(LIR组)，S组、LIR组组内按再灌注时间分为再灌注0h(To)、2h(T2)、4h(T4)，、8h(T8)4个亚组，每亚组6只。假手术组(S组)：成年SD大鼠，暴露股动脉后仅于股动脉表面穿过缝线，并不结扎股动脉，于相应时点取血及小肠组织，随即处死大鼠。缺血再灌注组(LIR组)：成年sD大鼠，分离暴露股动脉，动脉夹夹闭股动脉；再用市售橡皮筋(直径2．5cm)环扎大鼠双下肢近心端(压力290-310mmHg，1mmHg=0。133kpa)3，，再灌注0h、2h、4h、8h。于相应时点取血及小肠组织，并处死大鼠。2、大鼠肢体

7、缺血再灌注损伤模型的建立方法该实验操作过程均严格遵循有关实验动物保护规定，术前禁食不禁水，大鼠称II博士学位论文重后吸入2％．3％七氟醚浅麻醉下，将大鼠固定于试验台，采用文献【3】方法建立大鼠肢体缺血再灌注模型。具体方法：常规消毒后，切开皮肤、皮下，暴露股血管神经束，分离股动脉，动脉夹夹闭股动脉；再用市售橡皮筋(直径2．5cm)环扎大鼠双下肢近心端(压力290-310mmHg，lmmHg=0．133kpa)3h，再灌注Oh、2h、4h、8h。S组暴露股动脉后在其下方放一丝线，不阻断血流，LIR组阻断血流。3、大鼠肢体缺血再灌注损伤模型的鉴

8、定实验分为2组，即s组和LIR组。乳酸脱氢酶漏出量可以间接反映小肠组织损伤情况，通过全自动生化分析仪检测血清LDH释放量等方法验证LIR的小肠损伤作用。结果发现LIR组大鼠T2及以后各时点血清