调控内皮袓细胞自噬对深静脉血栓溶解再通作用的研究

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1、SOOCHOWUNIVERSITY博士学位论文论文题目调控内皮祖细胞自噬对深静脉血栓溶解再通■/作用的研究研究生姓名胡楠指导教师姓名.李晓强专业名称胸心血管外科研究方向干细胞治疗动静脉疾病论文提交日期2015年3月苏州大学学位论文独创性声明本人郑重声明：所提交的学位论文是本人在导师的指导下，独立进行研究工作所取得的成果。除文中已经注明引用的内容外，本论文不含其他个人或集体已经发表或撰写过的研究成果，也不含为获得苏州大学或其它教育机构的学位证书而使用过的材料。对本文的研究作出重要贡献的个人和集体，均己在文中以明确方式标明。本人承担本

2、声明的法律责任。论文作者签名：，柳日期：苏州大学学位论文使用授权声明本人完全了解苏州大学关于收集、保存和使用学位论文的规定，即：学位论文著作权归属苏州大学。本学位论文电子文档的内容和纸质论文的内容相一致。苏州大学有权向国家图书馆、中国社科院文献信息情报中心、中国科学技术信息研究所（含万方数据电子出版社)、中国学术期刊（光盘版）电子杂志社送交本学位论文的复印件和电子文档，允许论文被查阅和借阅，可以采用影印、缩印或其他复制手段保存和汇编学位论文，可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索。涉密论文口本学位论文属在____年_

3、_月解密后适用本规定。非涉密论文0^调控内皮祖细胞自噬对深静脉血栓溶解再通作用的研究中文摘要调控内皮祖细胞自噬对深静脉血栓溶解再通作用的研究中文摘要深静脉血栓形成(Deepvenousthrombosis，DVT)是临床常见血管外科疾病，可导致患肢深静脉瓣膜功能不全、疼痛、反复肿胀、浅静脉迂曲扩张、色素沉着、溃疡及肢体坏死等，严重时可导致致死性的肺栓塞(pulmonaryembolism，PE)。目前传统的药物抗凝和溶栓以及手术取栓治疗可引起机体凝血功能下降、消化道出血、手术患者切口并发症发生等并发症，且远期通畅率不理想，因此，如

4、何更加有效的治疗深静脉血栓是血管外科医生当前极为关注的研究方向。骨髓来源的内皮祖细胞(Bonemarrow-derivedendothelialprogenitorcellsBMEPCs)可以分化为血管内皮细胞，并分泌各种促血管生成因子从而促进缺血组织的血管新生。相关研究证实，EPCs可以归巢到深静脉血栓中，进而促进血栓机化再通。但是由于血栓内缺血缺氧的环境抑制EPCs的增殖、迁移和成血管等功能，因此如何更好的提高EPCs在缺氧环境下的功能成为其应用于治疗深静脉血栓的重点。自噬是机体保留下来的高度保守的保护机制，与细胞的生长、繁殖

5、，以及肿瘤的发生过程关系密切；它还是机体对外源性刺激如饥饿、缺氧、感染、药物、生长因子及氧化应激等的适应性反应，减少其对细胞产生的毒性作用。相关研究表明，自噬与细胞功能有紧密的联系，如在缺血组织中，上调细胞自噬水平可抑制细胞的坏死和凋亡。上调自噬可通过激活磷酸化AKT通路，从而对牛动脉内皮细胞的迁移和成血管功能具有明显的促进作用，下调自噬则抑制其功能。长时间的自噬会诱发细胞坏死和凋亡。查阅相关文献，我们发现调控自噬水平对于EPCs的功能影响，特别在深静脉血栓再通中的作用未见相关报道。本研究的主要目的是探讨自噬对内皮祖细胞功能影响及

6、促进静脉血栓再通的作用，为深静脉血栓的治疗提供一种新的治疗思路。分为四个部分，主要研究方法及结果如下。III中文摘要调控内皮祖细胞自噬对深静脉血栓溶解再通作用的研究第一部分大鼠骨髓源性内皮祖细胞的分离、培养及鉴定目的：分离、培养并鉴定大鼠骨髓源性内皮祖细胞(endothelialprogenitorcells，EPCs)。方法：采用密度梯度离心方法分离SD（Sprague-Dawley）大鼠骨髓单个核细胞（BMMNCs），采用内皮培养体系EGM-2培养基进行定向诱导分化培养14-21天，观察细胞的生长形态变化，采用免疫组化、免疫荧

7、光、流式细胞仪技术检测造血干细胞表面标记CD133及内皮细胞表面标记VEGFR、vWF，采用Matrigel成管实验及DiI-ac-LDL摄取实验检测其成血管及吞噬功能。结果：新分离的大鼠BMMNCs呈圆形，培养24-48h后可见其贴壁，细胞培养至第10～12天逐渐融合，并长满培养瓶底，呈现典型“铺路石或鹅卵石样”外观；DiI-ac-LDL摄取结果显示培养细胞具有内皮细胞吞噬DiI-ac-LDL的特性；Matrigel成管实验可见细胞可形成血管腔样结构；流式细胞仪分析及免疫荧光检测结果显示，细胞高表达VEGFR、vWF等内皮细胞标

8、记物，低表达或几乎不表达CD133造血干细胞标记物。结论：成功地建立了一套大鼠骨髓血管内皮祖细胞分离、培养、诱导分化及鉴定的方法体系。通过内皮培养体系EGM-2的诱导培养，可从SD大鼠BMMNCs中获得EPCs，培养到第14-21天的EPCs呈现晚