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1、自噬的分子标志物研究在生理状态下,细胞通过自噬(autophagy)清除衰老细胞器和突变蛋白,以维持自身结构稳定和功能正常。自噬还参与胚胎发育、免疫调节等生理过程。病理状态下细胞自噬水平显著升高,以耐受缺血、饥饿和凋亡等情况。此外,自噬功能的障碍还会导致某些疾病的发生。根据细胞内底物运送到溶酶体腔的方式不同,自噬可分为大自噬(macroautophagy)、小自噬(microautophagy)、分子伴侣介导的自噬(chaperon-mediatedautophagy,CMA)。此外,还有些选择性自噬如线粒
2、体自噬(mitophagy)、聚集体自噬(aggrephagy)等。不同类型的自噬其发生过程不同,参与的蛋白分子也不同。检测不同自噬过程中的分子标志物的水平、状态与定位有助于评价细胞的自噬水平。 1大自噬标志物 大自噬的囊泡膜结构起源于内质X和高尔基体等。这些膜片段形成杯状结构,包裹胞内物质并最终形成闭合的双层膜的囊泡即自噬体,然后自噬体与溶酶体融合,自噬体内蛋白质或细胞器在溶酶体中被溶酶体酶降解。因此该过程的标志物包括自噬体囊泡形成过程的标志物、溶酶体标志物和自噬底物标志物三类。 1.1自噬体标志物
3、 自噬相关蛋白(autophagy-relatedprotein,Atg)是一类自噬组成蛋白,参与调节自噬起始和延伸等过程。其中几个关键蛋白,也成为自噬标志物。 1.1.1Atg12-Atg5复合物Atg12与Atg5会形成复合物,甚至在一些哺乳动物细胞中似乎所有Atg5和Atg12都表现为结合体的形式。Atg12-Atg5复合物在自噬的形成中至关重要。此外,Atg12-Atg5复合物还可以充当Atg8-磷脂酰乙醇胺(phosphatidylethanolamine,PE)结合系统的E3样连接酶。Atg
4、12-Atg5的缺失会导致自噬缺陷。但在短时饥饿状态,Atg12-Atg5的水平改变并不明显。Atg12-Atg5复合物的水平检测可采用蛋白质印迹技术(1)DRAM1是一个具有六个跨膜结构的疏水蛋白。除了定位于顺面高尔基体,DRAM1也定位于早期和晚期内体和溶酶体,它与早期核内体相关蛋白1(early-endosome-associatedprotein1,EEA1)和溶酶体相关膜蛋白2(lysosomeassociatedmembraneproteintype2,LAMP-2)共定位。在应激情况下,DRA
5、M1可被活化的p53激活。DRAM1基因沉默会阻断自噬的发生。由于DRAM1分子质量很小,大约28kDa,加之其疏水性强,蛋白水平检测有一定难度,可考虑用实时定量PCR对其mRNA水平进行检测。 1.1.8ZFYVE1/DFCP1锌指FYVE结构域蛋白1(zincfingerFYVEdomain-containingprotein1,ZFYVE1)也被称为双FYVE结构域蛋白1(DFCP1),其羧基端即为两个锌结合的FYVE结构域。FYVE结构域参与膜转运和细胞信号,促进其与含PI3P的膜结合。ZFYVE
6、1/DFCP1与PI3P结合后,定位于内质X和高尔基体。饥饿诱导DFCP1转位至粗面内质X的粗粒上,显示在欧米茄体(omegasome)形成的部位。因此DFCP1可作为自噬形成初期的标志物。DFCP1的表达可用荧光免疫组化方法观察,出现DFCP1阳性的点状分布则意味着自噬囊泡正在开始形成期。 1.2溶酶体标志物 因为自噬过程最终的完成是在溶酶体中进行的,因此溶酶体标志蛋白在自噬功能研究中就显得极为重要。在酸性水解酶的作用下,进入溶酶体的自噬体内容物被降解。降解生成的可溶性小分子物质经自噬溶酶体膜渗透入细
7、胞质,参与细胞的物质代谢活动。目前已识别的25个溶酶体膜蛋白都是高糖基化的。含量最高的膜蛋白就是溶酶体相关膜蛋白1(lysosome-associatedmembraneproteintype1,LAMP-1)、LAMP-2和溶酶体整合膜蛋白(lysosomalintegralmembraneprotein,LIMP-2)。可用免疫组化或1,在多种细胞和组织中都有表达,可作为一个货车蛋白参与多种信号转导过程。p62可连接LC3和泛素化的底物,随后被整合到自噬体中,并在自噬溶酶体中被降解。当自噬被激活时自噬体
8、与溶酶体融合,自噬囊泡中p62等蛋白或细胞器被溶酶体酶降解,p62水平降低;当自噬被抑制时自噬体积累,p62水平升高。因此,可以用A的标志物 CMA是胞浆内某些蛋白质被分子伴侣如热休克蛋白质70(heatshockcognateproteinof70kDa,HSC70)识别,并将其运送到溶酶体膜上,再经溶酶体膜蛋白LAMP-2a结合后被转运到溶酶体腔中被溶酶体酶消化的过程。与大自噬和小自噬相比,CMA的主要特点
