诱导小鼠成纤维细胞为多能干细胞的研究

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1、东北林业大学硕士学位论文诱导小鼠成纤维细胞为多能干细胞的研究姓名：杨越飞申请学位级别：硕士专业：发育生物学指导教师：安铁洙20110629摘要诱导多能干细胞是当今的研究热点之一，该项技术在生物医学、细胞工程、组织工程和转基因动物生产等领域具有广泛的应用前景。本研究在克隆获得Sox2、Oct4、Ⅺ群和C-Mye基因的基础上，构建逆转录病毒载体pMXs-Sox2、pMXs-Oct4、pMXs．Klf4和pMXs-cMyc并获得病毒悬液。将获得的病毒悬液感染小鼠成纤维细胞后，观察其形成细胞克隆的能力及检测细胞克隆的碱性磷酸酶活性，

2、为进一步开展小鼠iPS的相关研究奠定基础。本研究的研究结果如下。(1)利用小鼠肝组织DNA扩增获得经PCR和酶切鉴定约在1000bp处出现特异条带的Sox2基因；利用小鼠囊胚RNA扩增获得经PCR和酶切鉴定约在1400bp处出现特异条带的Oct4基因；利用小鼠孕期19．5d皮肤组织RNA扩增获得经PCR和酶切鉴定约在1500bp处出现特异条带的Klf4基因；利用小鼠乳腺癌细胞RNA扩增获得经PCR和酶切鉴定约在1400bp处出现特异条带的c-Mye基因。对所获得的so)(2、Oct4、Klf4和e-Mye基因进行序列分析，其

3、与GenBank中相应序列的同源性分别为100％、99．91％、99．72％和100％。(2)利用克隆获得的Sox2、Oct4、Klf4和c-Myc基因，与逆转录病毒载体pMXs构建获得经PCR、酶切和测序鉴定正确的逆转录病毒载体pMXs—Sox2、pMXs．Oct4、pMXs-Klf4和pMXs--cMyc。(3)Sox2、Oct4、Klf4和c-Myc诱导因子的病毒悬液通过细胞免疫荧光检测其具有感染能力；将其感染小鼠成纤维细胞，经常规方法传代后第3d可见到ES样克隆出现，第7d进行挑克隆传代3次后诱导细胞具有典型的小鼠E

4、S细胞克隆形态，并且碱性磷酸酶活性检测呈现阳性的蓝紫色。综上所述，本研究运用成功克隆获得的s0)【2、Oct4、Klf4和e-Myc基因与逆转录病毒载体pMXs构建相应逆转录病毒pMXs-Sox2、pMXs-Oct4、pMXs-Klf4和pMXs-cMyc，利用其诱导小鼠成纤维细胞获得与小鼠ES细胞在形态学及生物学特征中极为相似的细胞克隆，为迸一步探讨哺乳动物iPS的相关研究奠定基础。关键词逆转录病毒载体：体细胞重编程；诱导多能干细胞东北林业大学硕士学位论文AbstractInducedpluripotentstemcell

5、sisoneofthefocusnowadays．Thistechnolgyhasawiderangeofapplicationsareasonthebiomedical，cellengiIl锄g，tissueengineeringandproductionoftransgenicanimals．Inthisstudy，weclonedSox2，Oct4，Ⅺ僻andc-Mycgene，andbasedonthisfourgenes，werespectivelylinkedthem诵廿1retroviralvectorpMXs

6、，thenconstructedpMXs-Sox2，pMXs-Oct4，pMXs-Klf4andpMXs-cMyc．Wegotthevirussupernatanttoinfectedmousefibroblastcells，thenobservedtheformationandtestingtheabilityofalkalinephosphataseactivityofcellclones,whichestablishedforthefurtherrelatedresearchofmouseiPS．Mainresults

7、andconclusionwereshowedasfollows：1．Sox2genewasextractedfromthemouselivertissueDNA,bYtheidentificationofPCRandrestrictionenzymedigestionappearedatabout1000bpspecificband；Oct4genewasextractedfromthemouseblastocystsRNA,bytheidentificationofPCRandrestrictionenzymediges

8、tionappearedatabout1400bpspecificband；l(1f4geneWasextractedfromthepregnancy19．5dmouseskintissueRNA,bytheidentificationofPCRandrestrictionenzymedi