水牛诱导多能干细胞的研究

《水牛诱导多能干细胞的研究》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在学术论文-天天文库。

1、广西大学博士学位论文水牛诱导多能干细胞的研究姓名：邓彦飞申请学位级别：博士专业：动物遗传育种与繁殖指导教师：石德顺201209水牛诱导多能干细胞的研究摘要体细胞诱导为多能干细胞是一种获取多能干细胞的新方法，即采用特异性转录因子，将体细胞重编程为具有于细胞特性的诱导多能干细胞(inducedpluripotentstemcells，iPSCs)，为胚胎干细胞建系困难的家畜提供一种获得多能干细胞的新途径。水牛是我国南方的主要家畜，除了为人类提供肉食和役用之外，其水牛奶营养丰富，是优质的奶源之一。但是，水牛的产

2、奶量低，其各方面的生产性能需要改进。采用干细胞介导的转基因克隆技术可以实现定点打靶转基因操作，是提高水牛生产性能的先进遗传改良技术之一。但是，关于水牛干细胞多能性相关的信号路径和培养条件等研究甚少，水牛胚胎干细胞的建系困难，要应用于基因打靶技术还存在诸多困难。因此，对水牛iPSCs这种新型多能干细胞的研究显得尤为重要。本研究首次采用逆转录病毒载体携带水牛特异性转录因子Oct4、Sox2、Klf4、c-Myc、Nanog和Lin28，对水牛成纤维细胞(BFFs)重编程为水牛诱导多能干细胞(biPSCs)的方

3、法和机理、biPSCs的生物学特性和表观遗传修饰等进行系统的探讨，以期为研究水牛干细胞信号通路和水牛遗传改良奠定基础。同时，本研究也利用iPSCs相关转录因子在物种间的高度保守性，使用水牛源的转录因子，对兔成纤维细胞(RFFs)重编程为兔诱导多能干细胞(耻PSCs)的方法和生物学特性等进行探索，为iPSCs应用于人类再生医学提供动物模型，同时也为兔遗传改良提供的手段之一。l、克隆和分析了水牛iPSCs相关的六个转录因子。参考GenBank中已公布的各个物种Oct4、Sox2、Klf4、c-Myc、Nano

4、g和Lin28(简称OSKMNL)的序列，设计、合成特异性引物。采用RT-PCR的方法，从水牛胎儿生殖嵴和小肠组织获取水牛OSKMNL的编码序列(CDS)。SV40largeTantigen(T)的编码序列采用同样方法从293T细胞获取。测序结果表明，OSKMNLT的基因CDS的长度分别为1083bp、966bp、1434bp、1320bp、903bp、618bp和2130bp。同源性分析表明，水牛OSKMNL氨基酸序列与牛、猪、人和鼠相应序列具有高度的保守件，同源性分别为：Oct4(98％、96％、91

5、％和81％)，Sox2(96％、95％94％和94％)，Ⅺf4(99％、97％、92％和92％)，c．Myc。(98％、96％、91％和86％)，Nanog(90％、81％、69％署n47％)，Lin28(98％、97％、89％和91％)。同时，采用PCR从水牛基因组中分段扩取Oct4和Nanog的基因组全长DNA序列。测序后拼接结果表明，水牛Oct4全长4508bp，包括5个外显子和4个内含子；Nanog全长4473bp，包括4个外显子和3个内含子。2、构建了不同的逆转录病毒载体和摸索出适合于生产水牛i

6、PSCs的病毒系统。采用pMSCV和pMX逆转录病毒载体携带绿色荧光蛋白(EGFP)标记基因，探索出能高效感染BFFs，用于生产水牛iPSCs的逆转录病毒系统和操作体系；同时，构建携带水牛特异性转录因子的逆转录病毒载体，建立生产iPSCs的小鼠模型，为水牛iPSCs的生产提供实验平台。结果表明，pMX介导的逆转录病毒系统所生产的假病毒感染BFFs的效率高于pMSCV逆转录病毒系统，pMX逆转录病毒系统更适合用于生产水牛iPSCs；超速离心后的重组假病毒，可以提高感染BFFs的效率；pMX病毒载体介导水牛转

7、录因子Oct4、．Sox2、Klf4和c．Myc可以将小鼠成纤维细胞重编程为iPSCs，碱性磷酸酶染色呈阳性，成功建立iPSCs小鼠模型；构建用于生产水牛iPSCs的逆转录病毒载体有pMSCV-EGFP，pMX—EGFP，pMX—Oct4-IRES-GFP，pMX-Oct4，pMX-Sox2，pMX-Klf4，pMX-C-Myc，pMX-Nanog，pMX—Lin28，pMX—LT，pMX—LT-IRES—GFP，pMX—hTERT-IRES—GFP(LT为SV40largeTantigen，hTERT为

8、人端粒酶逆转录酶，简称“hT”)。3、优化了水牛iPSCs诱导体系，并探索抑制p53表达来提高水牛iPSCs诱导效率。根据生产iPSCs常用的转录因子组合，探索出生产水牛iPSCs的转录因子组合。同时，在最佳组合条件下，探索SV40largeTantigen和p53抑制剂等提高重编程效率的可行性。将AP染色着色较深的iPSCs克隆视为统计对象的阳性克隆。结果显示，OSKM组合得到21个AP阳性克隆，OSNL没有得到阳性克隆，而