高效制备绵羊诱导多能干细胞的研究

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1、分类号：密级：学号：2011208008单位代码：10759石河子大学博士学位论文高效制备绵羊诱导多能干细胞的研究学位申请人史慧君指导教师陈创夫教授申请学位门类级别农学博士学科、专业名称动物遗传育种与繁殖研究方向动物胚胎工程所在学院动物科技学院中国〃新疆〃石河子2015年6月TheStudyofHighlyEfficientGenerationofSheepInducedPluripotentStemCellADissertationSubmittedtoShiheziUniversityfortheDegreeofDoctorofAgricultureByShihui-jun(Ani

2、malGeneticsBreedingandReproduction)DissertationSupervisor:Prof.Chenchuang-fuJune,2015课题来源农业部转基因重大专项项目名称：抗口蹄疫转基因猪育种新材料的研究项目编号：2009ZX08006-003B国家自然科学基金科学基金项目名称：利用TALENs技术制备myostatin基因敲除策勒黑羊的研究项目编号：31260534石河子大学学位论文独创性声明及使用授权声明学位论文独创性声明本人所呈交的学位论文是在我导师的指导下进行的研究工作及取得的研究成果。据我所知，除文中已经注明引用的内容外，本论文不包含其他个

3、人已经发表或撰写过的研究成果。对本文的研究做出重要贡献的个人和集体，均已在文中作了明确的说明并表示谢意。使用授权声明本人完全了解石河子大学有关保留、使用学位论文的规定，学校有权保留学位论文并向国家主管部门或指定机构送交论文的电子版和纸质版。有权将学位论文在学校图书馆保存并允许被查阅。有权自行或许可他人将学位论文编入有关数据库提供检索服务。有权将学位论文的标题和摘要汇编出版。保密的学位论文在解密后适用本规定。高效制备绵羊诱导多能干细胞的研究中文摘要绵羊是一种重要的经济动物，利用转基因技术能快速定向选育优质高产的绵羊新品种。然而传统的转基因技术克隆成功率低，获得的转基因个体常存在发育障碍。

4、基于胚胎干细胞（embryonicstemcell，ESC）的基因打靶技术能有效提高获得转基因小鼠的效率，但迄今为止，真正的绵羊的ESC很难获得。利用转录因子转导绵羊体细胞建立绵羊的诱导多能干细胞（sheepinducedpluripotentstemcell，siPSC）能代替ESC进行基因打靶制备基因修饰绵羊，但目前制备siPSC尚处于起步阶段，诱导效率非常低。因此，寻找一种高效快速诱导siPSC的方法十分迫切。siPSC的获得不仅能用于转基因绵羊的制备，还能为绵羊ESC的培养摸索条件，为探究体细胞重编程机制奠定基础；此外，siPSC在定向分化生殖细胞等功能细胞方面也具有广泛的应用

5、前景。目的：（1）分离三种绵羊体细胞以寻找最佳诱导siPSC的起始细胞，并制备培养siPSC的饲养层细胞；（2）构建p53干扰慢病毒质粒以提高绵羊体细胞重编程的效率；（3）构建ASF1A过表达的慢病毒质粒以提高体绵羊细胞重编程的效率；（4）高效诱导绵羊体细胞为siPSCs；方法：（1）组织块法分离培养妊娠45d左右的中国美利奴绵羊胎儿成纤维细胞（sheepembryonicfibroblast，SEF）和肾细胞（sheepkidneycell，SKC），全骨髓法分离培养绵羊胎儿骨髓间充质干细胞（bonemarrowmesenchymalstemcell，BMSC）；胰酶消化法分离孕12

6、.5d的CF-1小鼠胎儿成纤维细胞（mouseembryonicfibroblast，MEF），X-射线辐照处理P3代的MEF后冻存，用于培养siPSC；（2）根据GenBank数据库中绵羊p53基因的序列，设计干扰p53的短发夹RNA（shRNA），并克隆至慢病毒干扰载体pLentiLox3.7（pLL3.7），构建干扰绵羊p53基因的慢病毒干扰载体pLL3.7-p53-shRNA。使用无内毒素质粒提取试剂盒提取质粒pLL3.7-p53-shRNA和pLL3.7空载体及辅助质粒(VSVG、pMDL和REV)后在HEK-293FT细胞中包装慢病毒并测定滴度，以慢病毒MOI=10感染SK

7、C后，利用实时荧光定量PCR和Westernblot检测p53干扰效率，进而筛选干扰效率高的干扰片段用于进一步的siPSC诱导；同时，使用实时荧光定量PCR和Westernblot检测p21蛋白的表达情况；（3）根据GenBank数据库中绿色荧光蛋白EGFP和绵羊ASF1A基因序列，设计扩增EGFP和ASF1A基因的引物序列，分别以pEGFP-N1和绵羊cDNA为模板，扩增EGFP和ASF1A基因，并依次克隆至慢病毒表达载体pLEX-MCS，构