绵羊诱导多能性干细胞的制作与鉴定研究

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1、分类号：密级：学号：2012108032单位代码：10759石河子大学硕士学位论文绵羊诱导多能性干细胞的制作与鉴定研究学位申请人王聪慧指导教师张银国教授周平研究员申请学位门类级别农学硕士学科、专业名称临床兽医学研究方向动物临床疾病所在学院动物科技学院中国·新疆·石河子2015年6月TheresearchonproductionandappraisalofSheepinducedpluripotentstemcellsADissertationSubmittedtoShiheziUniversityInPartialFulfillm

2、entoftheRequirementsfortheDegreeofMasterofAgricultureByWangCong-hui(ClinicalVeterinaryMedicine)DissertationSupervisor:Prof.ZhangYin-guoResearcher．ZhouPingJune,2015本论文研究由以下项目资助：兵团种质资源创新专项(2012BB042)高产超细毛转基因羊新品种培育（2014ZX08008-001）新疆生产建设兵团院士资金专项（2012BB024，2014BB023）新疆农垦科

3、学院引导计划（49YYD201209）Thisstudywassupportedbythefollowingprojects:TheInnovationspecialofXinjiangproductionandConstructionCorps(2012BB042)ThebreedingofHighyieldandsuperfinewooltransgenicsheepvarieties（2014ZX08008-001）Thespecialfundsofxinjiangproductionandconstructioncorps

4、(2012BB024，2014BB023)ThescienceplanofXinjiangacademyofagriculturalreclamation（49YYD201209）摘要2006年，山中申弥利用病毒载体将四个转录因子（Oct4、Sox2、Klf4和c-Myc）感染小鼠体细胞，获得了类胚胎干细胞的诱导多潜能性干细胞（iPS细胞），为细胞学研究提供了新的方向，也为再生医学领域带来了广阔的应用前景。动物iPS细胞的出现对疾病模型的建立、细胞治疗，种质资源的保存、改善体细胞克隆动物的生产效率等方面都有着重要的意义。目的：在无

5、饲养层条件下建立电穿孔转染五因子制备绵羊iPS细胞，掌握iPS细胞诱导这一技术，为进一步研究细胞重编程机制及未来iPS细胞的临床应用奠定基础。方法：1本实验采用组织培养法，双酶法分离出中国美利奴成纤维细胞，并进行传代培养。2将含有人的Oct4；Sox2、Klf4；l-Myc、lin28基因的3个质粒，分别采用4-D电转染仪中EH-100，EN-150，CZ-167，CA-137四个电转程序转染到绵羊成纤维细胞中，筛选出最适合绵羊成纤维细胞的电转染程序；细胞密度和质粒浓度均相同，质粒+浓度不同对AP染色阳性（AP）克隆的影响；细胞密

6、度，质粒浓度均一致，质粒比例+不同，对AP克隆的影响；细胞密度，质粒浓度，质粒浓度均一致，培养液中有无添加+Vc，对AP克隆的影响，以选出最适合制备iPS的方案。3通过外形观察、定量PCR、免疫荧光染色、转录组分析等来检测所制备的绵羊类iPS细胞。结果与结论：（1）双酶法快速成功分离出中国美利奴绵羊耳源成纤维细胞，为重编6程的提供优良的体细胞。（2）采用EH-100电转程序，细胞密度为5×10个/mL，质粒比例1:1:1，质粒质量浓度为0.1mg/L，培养液中添加0.05mg/LVc条件下，AP染色阳+性（AP）克隆形成率达14%

7、，优化的电转染的方法和培养方案有效提升了绵羊类诱导性多潜能干细胞的制备效率。（3）在无饲养层条件下，通过电转染法将五因子导入绵羊耳源成纤维细胞，并成功重编程为类iPS细胞，在外观形态、多能基因的表达、转录组等方面的鉴定结果都表明其具有多潜能性，为以后进一步研究绵羊多潜能干细胞机制奠定了基础。关键词：诱导多能干细胞(iPS细胞)，电穿孔转染，无饲养层，重编程论文类型：A（基础研究）IAbstractIn2006,TherecombinantplasmidcontainingOct4,Sox2,Klf4,andc-Mycgeneres

8、pectivelywastransfectedintothefibroblastscellofmicebyviralvectorbyYamanaka,Inducedpluripotentstemcells(iPScells)theyobtaind,