猪脂肪干细胞源诱导性多能干细胞的获取与鉴定

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1、分类号：S814.8单位代码：10364密级：公开学号：S10090501515安徽农业大学学位论文猪脂肪干细胞源诱导性多能干细胞的获取与鉴定GenerationandCharacterizationofPorcineInducedPluripotentStemCellsReprogrammedfromAdipose-derivedStemCells研究生：张宇指导教师：张运海教授合作指导教师：章孝荣教授申请学位门类级别：农学硕士专业名称：动物遗传育种与繁殖研究方向：动物胚胎工程所在学院：动物科技学院答辩委员会主席：

2、二零一三年六月AnhuiAgriculturalUniversityMasterDegreeThesisGenerationandCharacterizationofPorcineInducedPluripotentStemCellsReprogrammedfromAdipose-derivedStemCellsPostgraduate:ZhangYuAcademicsupervisors:Prof.ZhangYunhaiProf.ZhangXiaorongCollegeofAnimalScienceandTechn

3、ology,AnhuiAgriculturalUniversity,Hefei,230036Anhui,P.R.ChinaJune,2013独创性声明本人声明所呈交的论文是我个人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果。尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得安徽农业大学或其它教育机构的学位或证书而使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示了谢意。研究生签名：时间：年月日关于论文使用授权的说明本人完全了解安

4、徽农业大学有关保留、使用学位论文的规定，即：学校有权保留送交论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借阅，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文。同意安徽农业大学可以用不同方式在不同媒体上发表、传播学位论文的全部或部分内容。研究生签名：时间：年月日导师签名：时间：年月日本项研究受下列基金资助1.国家重点基础研究发展计划项目（2009CB941000及2011CBA01001）2.国家自然科学基金项目（31272442）SUPPORTEDBY1.NationalBasicResearchProgramofCh

5、ina(2009CB941000and2011CBA01001)2.NationalNaturalScienceFoundationofChina(31272442)摘要诱导性多能干细胞(Inducedpluripotentstemcells,iPSCs)的出现，为突破家畜胚胎干细胞(Embryonicstemcells,ESCs)研究瓶颈带来了曙光，为获取稳定建系的家畜多能干细胞提供了一种可行的替代方案。遗憾的是，至今仅有极少数猪iPSCs能得到嵌合体后代或者核移植后代，并伴有高流产率、高死亡率和高畸形率等问题。因

6、而，如何获得高质量的猪iPSCs已成为该领域的研究热点和难点。本研究探讨了以猪的脂肪干细胞(Adipose-derivedstemcells,ASCs)为源头细胞开展重编程，旨在从源头细胞类型上进一步优化猪的体细胞重编程技术体系，以获得安全、可靠的iPSCs系，为今后进行iPSCs克隆猪生产，丰富转基因猪创制手段，或服务于人类iPSCs的安全性和有效性评价等奠定基础。本研究共开展如下试验。试验一源头细胞——猪ASCs的分离培养和生物学特征鉴定。我们通过胶原酶消化法从28日龄的长白猪皮下脂肪组织分离纯化出猪ASCs系，

7、并进行了全面的鉴定。结果发现：猪的ASCs拥有很强的增殖活力，显著高于取自同一头猪的耳源成纤维细胞(Earfibroblasts,EFs)；ASCs在体外能够进行长期传代培养，但拥有较高的异倍体率，且会随着传代周期而逐步上升；ASCs表达间充质干细胞特异性标记物CD44、CD90、CD29的比率依次为100%、96.5%、41.7%，而淋巴细胞标志物CD45、内皮细胞标志物CD31、成纤维细胞标记物HLA-DR的比率依次为0.148%、0.404%、0.08%，可忽略不计，表明细胞纯度很高；在体外合适的诱导条件下，A

8、SCs纵向分化能够产生油红O染色阳性的成熟脂肪细胞，横向分化能够产生茜素红染色阳性的成骨细胞钙化结节；ASCs中OCT4、SOX2、C-MYC、KLF4、NANOG以及LIN28基因均有内源性表达，但除了KLF4基因的表达量略高于相同代次EFs之外，其余几个重编程转录因子在ASCs中的表达量很低甚至不表达；基因组DNA去甲基化中间产物5-羟甲基