诱导性多能干细胞探究进展与前景展望

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1、诱导性多能干细胞探究进展与前景展望　　组织工程是应用工程学及生命科学原理和方法，实现组织保存、修复、功能维持和提高作用的生物学替代物的科学，目的是实现组织器官的功能修复。干细胞不仅可用于再生医学、组织工程，还可应用于生物生长发育机制的研究、药物筛选、基因治疗等领域。因核移植技术以及提取胚胎干细胞面临着材料不易获取、免疫排斥和伦理学争议，其研究发展受限。诱导性多能干细胞（inducedPluripotentstemcells，iPSC）是将影响全能性的外源转录因子基因导入分化的体细胞诱导其重编程成为类似于胚胎干细胞（Embryonicstemcells，ESC）的多能干细胞。iP

2、SC制备技术不需要胚胎和卵母细胞，克服了以上限制，应用前景广阔。1诱导性多能干细胞的产生102006年，Takahashi等[1]将24种与全能性相关的转录因子排列组合，利用逆转录病毒载体导入小鼠成纤维细胞，并通过Fbxl5报告基因（细胞多能性标志分子）筛选，确定了4种转录因子Oct4，Sox2，c-Myc和Klf4可将成纤维细胞重编程为iPSC，其在细胞形态、基因和蛋白表达、生长特性、标志物等方面与小鼠ESC十分相似。这些iPSC能形成畸胎瘤和嵌合体小鼠胚胎，但是不能形成成活嵌合体小鼠并参与到生殖遗传。后来，Okita等[2]改选Nanog进行筛选建立的iPS细胞系相比Fbx

3、15筛选得到的iPSC在基因表达谱和DNA甲基化模式上与ESC更接近，且能够参与成活的嵌合体小鼠生殖系细胞的遗传。2007年，Takahashi等[3]建立了人iPSC，美国Thomson实验室[4]同时报道通过慢病毒转导Oct4，Sox2，Nanog及Lin28四个基因也能将新生儿包皮成纤维母细胞成功重编程为iPSC。随后，多种来源体细胞都被重编程为iPSC。2iPS细胞制备技术的优化2.1转录因子的选择：选择转录的除了由其本身的全能性决定外，还可根据加入的小分子化合物和体细胞内源性转录因子表达水平等多方面综合考虑进行优化。Kim等[5]发现Oct4是必需的，外源Sox2、K

4、lf4和c-Myc10表达不是iPSC产生的必要条件，其作用是提高诱导效率。增加转录因子使用个数，如：采用六因子（Oct4，Nanog，Sox2，Lin28，c-Myc和Klf4）可显著提高重编程效率[6]，然而转录因子作为外源基因对iPSC的安全也构成了威胁。小分子化合物可替代某些转录因子并提高重编程效率，其机制可能是小分子化合物诱导内源性转录因子的表达，因此有利于安全性的提高。Huangfu等[7]在对组蛋白脱乙酰基酶抑制剂-丙戊酸（VPA）的一系列研究发现，利用VPA可以使只有Oct4、Sox2转录因子的体细胞成功诱导为iPSC。对于小分子化合物的研究加深了对重编程的信号

5、通路和分子机制的研究，使我们能更好地理解体细胞重编程机制。研究已发现有效的小分子化合物还有VitC、PD0325901、CHIR99021、P53siRNA和UTF1等，均可提高iPSC产生效率。2.2外源因子导入方式：逆转录病毒是首次产生iPSC所使用的载体，以逆转录病毒和慢病毒为载体的转染方式会使外源基因和载体序列整合。多病毒整合位点引起的插入突变会干扰正常基因功能，而外源基因的表达会影响细胞分化，导致肿瘤发生。2008年，Stadtfeld等[8]和Okita等[9]分别使用腺病毒和质粒来瞬时转染细胞，成功获得无外源基因整合的iPS细胞，但诱导效率低下。2009年，研究者

6、[10-12]利用Cre/LoxP重组系统，oriP/EBNA1质粒和piggy-Bac转座子系统将外源基因从iPS细胞中切除，这些方法较为繁琐，安全性也有待验证。直接导入转录因子蛋白或mRNA，被认为是最安全的方法，在重编程因子蛋白上连接细胞穿膜肽组成融合蛋白，可穿透细胞膜进入细胞内部，执行其重编程的功能，蛋白诱导小鼠和人体的iPSC都已实验成功[13]。但是其诱导效率低，且蛋白容易失活。Warren等[14]将4个产生重编程蛋白的mRNA导入细胞以诱导iPS细胞，这种方法效率较高，诱导时间也只需原来的一半。2.310体细胞的选择：不同分化阶段的体细胞，在重编程的难易程度、效

7、率、所需因子组合或克隆形成所需时间等方面上是不同的。分化程度低的体细胞，如：神经干细胞、间充质干细胞，其重编程大大易于终末分化的体细胞。同时有研究显示不同来源的iPSC在肿瘤形成上存在很大差异。Aoi等[15]发现成纤维细胞来源的iPSC成瘤性比肝脏细胞和胃表皮细胞来源的iPSC成瘤性要高很多。Sun等[16]发现采用人脂肪干细胞作为供体细胞，效率是皮肤成纤维细胞的20倍，原因可能是脂肪干细胞内源性转录因子的高表达。也有研究[17]采用血细胞来获得iPS细胞，使得其产生方式更为便捷。此外，Y