诱导性多能干细胞若干关键问题的研究进展

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重庆医学2010年9月第39卷第18期2521·综述·诱导性多能干细胞若干关键问题的研究进展李家速，赵宜香。综述，姚忠祥弘审校(1．第三军医大学学员旅四队，重庆400038；2．第三军医大学组织胚胎学教研室，重庆400038；3．中国药科大学中药学院09453班，江苏南京2】1198)关键词：诱导性多能干细胞；诱导；安全性；效率doi：10．3969／j．issn．1671—8348．2010．18．064中图分类号：R392．4；R457．7文献标识码：A文章编号：1671—8348(2010)18—2521—032006年，Takahashi和Yamanaka[1研究小组利用逆转录胞的多潜能性]。但是由于所需外源因子个数不确定和重编病毒将Oct3／4、Sox2、c—myc和Klf4四个转录因子(fourtran～程目标细胞的异质性等原因，重编程潜在的分子机制还是不完scriptionfactors，4TFs)导入小鼠已分化的成纤维母细胞，再应全明了。用小鼠胚胎干细胞(embryonicstemcell，ESc)培养条件将其去2低毒性或无毒性载体的使用分化，重编程为诱导性多能干细胞(inducedpluripotentstem最早得到的iPS是经由原癌基因c—myc或其蛋白产物生cell，iPS)。iPS在形态结构、表面标志物、增殖分化和畸胎瘤形成的，Klf4也牵涉致癌作用，而且是通过逆转录病毒、腺病毒成等方面与ESc极为相似，因此，其在移植免疫排斥、干细胞及慢病毒来介导的，易导致外来因子异位表达整合人宿主细胞治疗、组织器官再生以及法律伦理学等方面极具优势。自此以的基因组，存在变异、自身基因表达调节失调、移植后肿瘤形成后，iPS便成为多领域的研究热点，在诱导的因子、载体安全等风险，从而阻碍其未来的临床应用。最近的研究利用DNA性、效率等方面都取得了举世瞩目的成果。本文将对iPS诱导转座子、质粒及游离载体等，诱导成功后剔除外源性插入物，在重编程的最新研究进展进行综述。iPS安全性方面取得了突破性进展。1诱导产生iPS的必要因子Kaji等以含有遗传序列DNA片段的转座子替代病毒Takahashi和Yamanaka[研究小组证实了4TFs的组合作为多蛋白表达载体，在CAG增强子的驱动下，将串联在2A可以诱导iPS的产生，但诱导的效率较低，安全性方面也存在寡肽序列上的4TFs同时导入鼠和人多能性标记物高表达的风险，因此这些转录因子是否具有可替代性，是否均为必要因成纤维细胞，成功获得iPS后又利用Cre重组酶瞬时转染系子等问题还有待深入研究。统，将外源性重组因子尤其是c—myc切除，降低了致癌风险，极Yu等_2利用慢病毒载体介导Oct4、Sox2、Nanog和Lin28大地增强了iPS在再生医学、药物筛选和构建疾病模型等方面4种转录因子，成功诱导胎儿成纤维细胞转化为具有人ESc特的应用性。此方法的优点在于载体拥有自我剪切的能力，可以征的iPS；Zhou等则利用腺病毒介导Ngn3、Pdxl、Mafa3种在移植后被剔除，但此途径重组效率偏低，还有待进一步研究。转录因子转染成年动物的胰腺外分泌细胞，成功转化为胰岛BSoldner等。。利用Cre重组酶在生成iPS后将外源性重组细胞；而Huangfu等只用Oct4、Sox2就生成了人成纤维细因子去除，尽管保持了iPS的可塑状态，但依旧不能避免残余胞的iPS，说明Oct4、Sox2在诱导重编程的过程中是必需的。插入物导致的基因突变。Woltjen等采用相似的不依赖病Kim等[利用单个转录因子Oct4的异位表达，即人为操纵外毒的单一化转座子piggyBac表达载体，介导可诱导的特殊转源基因Oct4的导入和表达，成功诱导人胎儿神经干细胞转化录因子多西环素(doxycycline)，易化导人宿主细胞基因组，产为iPS，证实Oct4在分子水平诱导多潜能性方面不仅是必要生稳定的iPS；接着他们利用具有天然属性的piggyBac系统转的而且是能够胜任的，实现单因子诱导iPS的创举。Oct4座酶的瞬时表达，无痕迹地去除iPS的外源性插入物即致癌基是多能干细胞的标记物，被认为是只在多能干细胞中高水平表因，从而使生成的iPS更安全和高效。达的转录因子，通过外源性信号分子介导的信号转导通路，与由此可见，2A寡肽序列的应用不仅使得诱导所需的转录内源性转录因子Nanog、Sox2等共同组成基因调控网络，以维因子在单一结构上递送，而且使得外来结构的完全切除变得更持干细胞的多能性，因其作用的多样性和表达的特异性而被认加容易。这项新技术在加速重编程机制的深入研究和未来的为是控制干细胞多能性的决定性因素]。通过逆转录病毒将细胞治疗方面有重大意义。倘若与microRNA、基因标记等技Oct4导人胎儿神经干细胞，嵌入鼠内细胞群，并在人ESc条件术结合起来，安全效果可能会更好。下培养，直到ESc样克隆能被机械分离和进一步增殖分化，并Okita等”使用两个质粒作为载体，一个质粒包含编码通过多种筛选手段证实单因子Oct4诱导产生的该iPS无论是Oct3／4、Klf4和Sox2的cDNAs，另一个含有编码cmyc的cD—在基因表达谱、表观遗传学特征还是在体内外的全能性上，都NAs。前者连接在来自致病病毒的、可自行分裂的2A寡肽序与人ESe非常相似。这项成果将极大地推进对重编程机制的列上，通过质粒反复转染小鼠胚胎成纤维细胞，经PCR筛选，理解和制备患者特异性多潜能干细胞的研究。可获得无功能性转基因表达的iPS，移植入裸鼠可以生成畸胎有研究通过同时利用多种因子的不同组合重编程神经干瘤，以及促成成熟嵌合体。这种在质粒介导下生成iPS的方细胞的细胞模型，证实Oct4和Klf4已经足够诱导出神经干细法，对阐明重编程和全能性的潜在机制意义重大。但此法的速*基金项目：国家自然科学基金资助项目(30572364)。通讯作者，电话：023—68775266；Email：yaozhx@yahoo．com。 2522重庆医学2OlO年9月第39卷第18期度较慢，效率仍然较低，至于是否适用于其他组织器官和物种损伤具有重要作用。而且，只有当诱导DNA损伤的重组因子还有待于进一步研究。被引进后，p53途径才会被激活，因此，避开DNA损伤的细胞Jia等则在已有质粒编码POU5F1(即OCT4)、SOX2、不可能开启p53途径，而效率低的原因可能与被编程细胞的IAN28和NANOG的基础上，外加一个GFP报告基因的2ADNA损伤有密切关系。该研究同时发现，由于端粒缩短导致序列，基于PhiC31的分子内重组系统除去或退化细菌质粒主的DNA损伤增强的鼠成纤维细胞(G3Terc2／2MEFs)不能被链，再将其纯化和分离，获得minicircle载体，即一种具有超螺诱导为iPS，尽管这些野生型细胞拥有正常的增殖速率和被癌旋结构的DNA分子，诱导多潜能性的人脂肪干细胞，从而获基因转染的能力，故而推测诸如缩短的端粒等可能是阻碍得无转基因的人iPS。和单纯质粒相比，由于外源性沉默机制DNA损伤的野生型细胞被重编程的主要障碍。为了证实p53活性的降低，此法具有更高的转染率和异位基因表达能力，因与DNA损伤的野生型细胞增殖的密切关系，在p53存在与缺此被认为可能是iPS生成的理想策略。Yu等则使用无需失的情况下，利用Oct4、KII4和Sox2重编程端粒缩短了的野整合的游离载体，生成的iPS完全脱离载体和转基因序列，在生型细胞来检测p53的作用，经过反复诱导和比照，发现p53增殖和分化潜能方面与人ESc1一分相似。此外，选择恰当的可能是通过限制翻译，来阻碍诱导鼠和人DNA损伤的野生型体细胞也对诱导产生的iPS的安全性极为关键。Miura等细胞形成iPS，并通过p53依赖的细胞凋亡机制清除这些细用11种途径合成了36个鼠iPS，通过形成次级神经球(see—胞，而且这种效应在功能失调的端粒或外源性高比例DNA损ondaryneurospheres)来评估畸胎瘤形成的机制。为了搞清楚伤的野生型细胞将会恶化。数据显示在这个过程中，p53对这些次级神经球在体内的表现特征，将这些次级神经球移植入DNA损伤是致敏的，而且p53是通过介导多潜能性诱导阶段实验鼠大脑，并进一步解剖检测畸胎瘤的形成。来自鼠ESc的欠佳细胞的凋亡来限制重编程的，因此，可以认为p53在重的3个克隆移植人34只鼠脑后，有3只死亡，其中1只形成畸编程和转化这两个过程中，对损伤细胞都发挥着重要的控制作胎瘤，发病率为2．9；来自鼠胚胎样成纤维细胞的12个iPS用。但是，持久抑制p53会增强基因组的不稳定性，因而会影移植入1OO只鼠脑后，有33只形成大小不等的畸胎瘤，发病率响iPS的生成E21]。为33．0；而来自鼠尾尖成纤维细胞的11个iPS移植入55只Li等l2证实INK4／ARF基因座的激活是iPS诱导过程鼠脑后，有46只形成畸胎瘤，发病率为83．6；来自鼠肝细胞中限制速率的又一障碍。通常情况下，INK4／ARF基因座是的7个iPS移植入36只鼠脑后，有13只死亡，其中1O只形成处于静默状态的，在诱导过程中被激活。研究证实，抑制畸胎瘤，发病率为27．8；而来自鼠胃上皮细胞的2个iPS移INK4／ARF基因座的活性，对iPS诱导效率产生极大地正面效植入8只鼠脑内，没有观察到畸胎瘤。应，而同时抑制p53和INK4／ARF基因座的活性，则增强了细上述数据显示，由不同成体细胞衍生的iPS，生成的次级神经胞的自我更新能力，从而使体细胞的重编程变得容易~2aJ。球在形成畸胎瘤的危险性上存在很大差异。冈此，选择何种体Iin等利用AIK5抑制剂SB431542和MEK抑制剂细胞来诱导产生iPS，是未来细胞治疗面临的严峻挑战之一。PD0325901提供的化学平台，将诱导效率提高到常规方法的同时，这项研究也验证了Yamanaka{”一的随机模型认为的，大100多倍。常规方法用未经处理的、编码4TFs的cDNAs转染部分乃至全部的分化细胞在导入4TFs后都有诱导为iPS的潜后，形成若干颗粒状克隆，暗示其只是不完全的重编程克隆；在力。此外，研究还认为cmye逆转录病毒的使用并不影响次级只有SB431542的情况下，同样观察到颗粒状克隆，数目比人神经球畸胎瘤的形成倾向，而且也没有检测到cmyc或其他转ESc样克隆多几倍；而在SB431542和PD032590l组合使用的录因子在iPS或次级神经球内的复活，但对于不同畸胎瘤形成情况下，颗粒状克隆大大减少，人ESc样克隆却伴发性增加，倾向的潜在机制还有待进一步的研究。说明此两种抑制剂的组合可引导不完拿重编程克隆状态转变3高效诱导产生iPS的可能机制为完全的重编程克隆状态，从此推进整个重编程进程。此外，可能由于外源因子使得组织干细胞变形、病毒整合人特定经此两种抑制剂处理过的cDNAs，7d即可诱导出iPS，大大加的基因组位点以及插入的拷贝数不确定等缘故，Yamanaka研速了重编程的动力学进程。进一步的研究还发现，一种小分子究小组及以前的诱导iPS的研究成功率只有0．067。。但随Thiazovivin与SB43l542和PD0325901混合后，能大大提高着研究的深入，基因路径阻断剂、化学小分子抑制剂等的应用，iPS分离后的存活率，获得更多的重编程克隆。为了检测Thi—在加速诱导进程、提高效率等方面发挥了重要作用。azovivin在高效分离的同时是否对SB431542和PD0325901组Hong等在抑制p53和缺乏逆转录病毒cmye的条件合产生促进作用，利用三者混合物再次诱导，发现诱导效率提下，转染鼠胚胎成纤维细胞，经Nanog—GFP报告基因系统进行高了近200倍，并缩短了转化周期。易感性和特异性鉴定，证实为iPS，转化率提高了10。同时上述新方法的独特之处在于调整了上游的信号途径，而且证实在p53缺失背景下，可以将终末分化的T淋巴细胞去分能快速改进普通细胞类型的重编程，能够为非病毒、非DNA化重编程为iPS。他们利用DNA微阵列技术(microarray)，分依赖的更高效率和更安全的重编程进程提供基础性平台，从而析人和鼠的成纤维细胞中均受p53调节的34个共有基因，证为各种各样的应用提供极其安全的人iPS。如果将前述的小明p53可以抑制细胞癌变。Aparicio和Eaves[1。则认为p53分子抑制剂l2和恰当的供体细胞类型策略【埘结合起来，效果途径在正常组织体内平衡和肿瘤形成的调控方面发挥重要作可能会更上一层楼。用。这在一定程度上说明，上述途径虽然提高了转化率，但也此外，蛋白质合成阻碍剂valproicacid(VPA)、低氧环增加了新形成的iPS致癌风险。Mariofin等】认为p53介导境l2以及维生素C同样可以提高iPS的诱导效率，此方面的DNA损伤响应限制了重编程，从而确保了新形成的iPS基的研究还在深入，前景诱人。因组的完整性。在敲除p53的情况下，提高转化率的同时，却4小结面临着DNA损伤，并长期伴随着iPS形成异常以及染色体异目前关于iPS的研究正如火如荼的进行着，在iPS诱导的常等风险。因此，p53对预防来自欠佳的亲本细胞的iPSDNA原料、效率、安全性等方面都取得了可喜的进展。此外，在iPS 重庆医学2010年9月第39卷第18期2523的全能、临床应用等方面也收获甚大。通过四倍体囊胚注射[12]OkitaK，HyeniongH，TakahashiK，etaI．Generati0nof方法证实iPS全能性的小鼠已经诞生，还有诱导产生患者特异mouse—inducedpluripotentstemcellswithplasmidvee—性iPS的报道，在原材料的获取、移植免疫排斥、干细胞研究，tors[J]．Natureprotoc，2O10(5)：418．退行性或损伤性疾病等方面优势显著。但总体而言，诱导的效[13]OkitaK，NakagawaM，HyenjongH，eta1．Generationof率还有待提高，安全性还需改进，遗传学的稳定性及后续变化mouseinducedpluripotentsterncellswithoutvira1vec—证据尚显不足，诱导极具多潜能性的耕作动物细胞(如牛、马tors[J]．Science，2008，322(5903)：949．等)的研究才刚起步(已经培养出猪源iPS系)，重编程的分子[14]JiaFJ，WilsonKD，SunN，eta1．anonviraiminicirclevec—调控机制目前还不是很清楚，因此，iPS应用于临床实践还为torforderivinghumaniPscells[J]．Naturemethods，时尚早。但相信，随着研究的深入，iPS所具有的优势在自体2010，7(3)：197．细胞替代治疗、再生医学、发育生物学、药物开发、疾病模型等[15]YuJY，HuKJ，Smuga—OttoK，eta1．Humaninducedplu—方面的临床应用前景是广阔的，必将给相关疾病的患者带来ripotentstemcellsfreeofvectorandtransgenesequences福音。[J]．Science，20．09，324：797．[16]MiuraK，OkadaY，TakashiA，eta1．Variationinthesafe—参考文献tyofinducedpluripotentstemcelllines[J]．NatureBio—EliTakahashiK，YamanakaS．Inductionofpluripotentstemtechnol，2009，27(8)：743．ceilsfrommouseembryonicandadultfibroblastculturesr17]YamanakaS．Eliteandstochasticmodelsforinducedplu—bydefinedfactors[J]．Cell，2006，126(4)：663．ripotentstemcellgenerationEJ]．Nature，2009，460[2]YuJY，VodyanikMA，Smuga—OttoK，eta1．Inducedplu—(7251)：49．ripotentstemcelllinesderivedfromhumansomaticcells[18]HongHJ，TakahashiK，IchisakaT，etat．SuppressionofEJ]．Science，2007，3l8：1917．inducedpluripotentstemcellgenerationbythep53一p21[3]ZhouQ，BrownJ，KanarekA，eta1．Invivoreprogram—pathway[J]．Nature，2009，460：1132．mingofadultpancreaticexocrinecellstopcells[J]．Na—[19]AparicioS，EavesCJ．p53：anewkingpininthestemcellture。2008，455：627．arena[J]．Cell，2009，138：1060．[4]HuangfuD，OsafuneK，MaehrR，eta1．Inductionofpluri—r2O]MariofinRM，StratiK，LiH，eta1．Ap53一mediatedDNApotentstemcellsfromprimaryhumanfibroblastswithdamageresponselimitsreprogrammingtoensureiPScellonlyOct4andSox2EJ]．NatureBiotechnol，2008，26(11)：genomicintegrity[J]．Nature，2009，460：1149．1269．[21]LiuY，ElfSE，MiyataY，eta1．p53regulateshematopoiet—[5]KimJB，GreberB，MarcosJ，eta1．Directreprogrammingicstemcellquiescence[J]．CellStemCell，2009，4：37．ofhumanneuralstemcellsbyOCT4EJ]．Nature，2009，r22]LiH，ColladoM，VillasanteA，eta1．TheInk4／ArflOCUS461：649．isabarrierforiPScellreprogrammingEJ]．Nature，2009，[6]KimJB，SebastianoV，wuG，eta1．Oct4InducedPluripo460：1136．tencyinAdultNeuralStemCells[J]Cell，2009，136(3)：[23]UtikalJ，PoloJM，StadtfeldM，eta1．Immortalizatione～411．liminatesaroadblockduringcellularreprogramminginto[7]BabaieY，HerwigR，GreberB，eta1．AnalysisofOct4一deiPScells[J]．Nature，2009，460：1145．pendenttranscriptionalnetworksregulatingself—renewal[24]LinTx，AmbasudhanR，YuanX，eta1．Achemicalplat—andpluripotencyinhumanembryonicstemcells[J]StemformforimprovedinductionofhumaniPscs[J]．NatureCells，2007，25(2)：500．Methods，2009，6(11)：805．[8]KimJB，ZaehresH，wuG，eta1．Pluripotentstemcellsin—[25]HuangfuD，MaehrR，GuowJ，eta1．Inductionofpluripo—ducedfromadultneuralstemcellsbyreprogrammingtentstemcellsbydefinedfactorsisgreatlyimprovedbywithtwofactors[J]．Nature，2008，454：646．smallmoleculecompounds[J]．NatureBiotechnol，2008，[9]KajiK，NorrbyK，PacaA，eta1．Virus—freeinductionof26(7)：795．pluripotencyandsubsequentexcisionofreprogramming[26]YoshidaY，TakahashiK，OkitaK，eta1．Hypoxiaen—factors[J]．Nature，2009，458：771．hancesthegenerationofinducedpluripotentEJ]．Cell[1O]SoldnerF，HockemeyerD，BeardC，eta1．Parkinsonsdis—StemCell，2009，5：237．easepatientderivedinducedpluripotentstemcellsfreeof[27]EstebanMA，WangT，QinBM，eta1．VitaminCenhancesviralreprogrammingfactors[J~．Cell，2009，136：964．thegenerationofmouseandhumaninducedpluripotent[11]WoltjenK，MichaelIP，MohseniP，eta1．piggyBactrans—stemcells~J]．CellStemCell，2010，6：71．positionreprogramsfibroblaststoinducedpluripotentstemceils[J]．Nature，2009，458：766．(收稿日期：2010～0518修回日期：201O-06—01)