人类诱导性多能干细胞技术指导手册

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1、人类诱导性多能干细胞（iPS细胞）技术指导手册目录：1.前言12.人类胚胎成纤维细胞培养23.重编程载体构建34.病毒包装45.人类iPS细胞的诱导66.iPS细胞鉴定86.1碱性磷酸酶活性检测86.2干细胞表面marker的免疫染色检测96.3干性因子的去甲基化程度分析106.4干细胞内源基因的表达分析136.5端粒酶活性检测146.6核型检测156.7拟胚体形成156.8畸胎瘤形成实验157．干细胞技术培训及服务一览表158．附录161.前言iPS细胞最初从成纤维细胞重编程而来，因为它们准备和操作相对简单。其他细胞类型，包括来自

2、外胚层、中胚层和内胚层的细胞也可以用于产生iPS细胞（Eminilietal2008）。2006年Yamanaka和Takahashi利用逆转录病毒系统在成鼠的成纤维细胞导入四个转录因子（Oct3/4,Sox2,c-Myc,和Klf4，Yamanaka因子），将其重编程为iPS细胞，它具有跟小鼠ES十分相似的特性，尤其重要的是，iPS细胞也能产生后代。2007年，iPS技术在人类体细胞中得以应用，人类iPS细胞的产生对退行性疾病的治疗产生巨大的影响（Takahashietal;Yuetal,2007）。由于iPS细胞具有和ES类似的

3、功能，却绕开了胚胎干细胞研究一直面临的伦理和法律等诸多瓶颈，因此在医疗领域的应用前景非常广阔，成为干细胞研究的热点，《自然》和《科学》杂志分别将其评为2007年第一和第二大科学进展。随后，iPS细胞的研究日新月异。.近几年来，iPS研究方面取得的一系列的重大成果让我们欣喜不已，然而，这才刚刚开始，iPS细胞能真正用于临床惠及大众还面临着很多技术上的问题。一方面iPS产生的方法有待改进；另一方面iPS细胞的定向分化手段需继续探索。斯丹赛干细胞生物技术公司拥有成熟稳定的胚胎干细胞/iPS细胞技术平台，将竭力为全国各类进行干细胞/iPS研

4、究的科研机构、高校、相关医疗机构和制药企业等提供高品质产品和优质的服务。目前，公司提供两种人类iPS细胞系，分别由4因子和6因子所诱导，方便科研工作者做后续的研究。细胞系名称货号SiDSH-01HIPS-01SiDSH-03HIPS-03另外，对于新手提供初学者试剂盒：名称货号包装人类胚胎干细胞/iPS细胞胚胎初学者试剂盒HESM-1KT1kit小鼠胚胎干细胞/iPS细胞胚胎初学者试剂盒MESM-1KT1kit人类诱导多能干细胞产生初学者试剂盒HiPS-1KT1kit小鼠诱导多能干细胞产生初学者试剂盒MiPS-1KT1kit这些产品

5、都是经过严格的质控，为您科研的成功提供了基本的保证。2.人类胚胎成纤维细胞培养材料：ü人胚肺成纤维细胞：货号SDSC-07，SDSC-08规格1*106/支；ü人类胎儿包皮成纤维细胞：货号SDSC-17，规格1*106/支；ü0.25%trypsin：胰酶，Sidansai，货号M-005-1，M-005-2；ü含10%FBS的DMEM：成纤维细胞完全培养液，Sidansai，货号：EFM-01。实验步骤：人类成纤维细胞培养及传代方法基本与293T细胞相同。先吸弃废液，用0.25%Trypsin消化（一般T25瓶加1ml即可），放培

6、养箱3－5分钟，待细胞大部分脱落时就可加含FBS的DMEM培养液终止消化，反复吹打至细胞至单细胞悬浮液即可。传代比例为1：3－1：5。PointØ此细胞系消化时间比293T细胞稍长，请不要在加入Trypsin后马上拍打使其脱落，否则会导致细胞结块，吹打不散。Ø细胞传代比例大概为1：3-1：5，不能传得太稀，否则不易生长甚至停止生长。Ø传代间隔时间为3－4天。3.重编程载体构建用于重编程的病毒载体，其构建方法与普通载体构建的方法基本相同，一般用慢病毒、腺病毒或逆转录病毒质粒作为质粒构建的载体：质粒名称货号iPS慢病毒载体Lenti-o

7、ct4-GFPPlvO-01Lenti-sox2-GFPPlvO-02Lenti-cMyc-GFPPlvO-03Lenti-klf4-GFPPlvO-04Lenti-nanog-GFPPlvO-05Lenti-lin28-GFPPlvO-06Lenti-SV40LT-GFPPlvO-07iPS腺病毒载体Ad-Oct4-GFPpAD-01Ad-Sox2-GFPpAD-02Ad-cMyc-GFPpAD-03Ad-Klf4-GFPpAD-04Ad-Nanog-GFPpAD-05Ad-Lin28-GFPpAD-06Ad-Htert-GFPp

8、AD-074.病毒包装材料：ü293T细胞：Sidansai，货号Plv-C-01ü转染试剂Fugene：Roche，货号4709713001实验步骤1．包装细胞铺板：①.传代293T细胞前将T75培养瓶用明胶包被，每瓶T75加1.5