诱导小鼠胎儿成纤维细胞为多能干细胞的共孵育方法研究

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1、西南大学硕士学位论文诱导小鼠胎儿成纤维细胞为多能干细胞的共孵育方法研究姓名：张翠平申请学位级别：硕士专业：临床兽医学指导教师：李跃民20120601摘要多重耐药大肠埃希菌喹诺酮类药物外排泵抑制剂中药活性成分的筛选及其作用机制研究基础兽医学专业硕士研究生张静指导老师吴俊伟教授(摘要)近年来，随着抗微生物药物的广泛应用，抗微生物药物耐药性问题也日趋严重，这导致药物临床疗效的降低，甚至无效，感染畜禽的发病率和死亡率明显升高。而现有药物对细菌耐药性问题控制较难，研制耐药抑制剂逐渐成为药学领域中的研究热点。针对如何解决细菌耐药性问题，国外研究

2、人员已研制了部分耐药性抑制剂，如利血平、氰氯苯腙(CCCP)、2，4一二硝基酚(DNP)等，虽然其对耐药性均有一定的抑制作用，但其本身的毒性也较大。因此，研究低毒、有效的耐药性抑制剂具有广阔的应用价值和良好的前景。中药是我国特有的天然资源，具有资源广、毒副作用低等特点，在治疗感染、逆转(或抑制)肿瘤细胞耐药性等方面显示了独特的作用，这提示可以在中药中寻找既有良好耐药消除效果又没有毒副作用或毒副作用较低的耐药抑制剂。本试验目的在于通过以临床常见100味中草药为研究对象，筛选对多重耐药大肠埃希菌喹诺酮类药物具有外排泵抑制作用的中药活性成

3、分，旨在为研制新的耐药抑制剂奠定基础。1．具有单一外排耐药机制的大肠埃希菌模型的确立以本研究室鉴定、保存的20株多重耐药大肠埃希菌为样本，进行染色体DNA提取，通过PCR方法扩增∥彳和艘，C基冈耐药决定区，产物测序分析。基因耐药决定区未发生突变者，应用实时荧光定量PcR技术，对其外排泵基因口c脚表达量进行检测，并应用CCCP为外排泵抑制剂进行检测，高表达且经cCCP处理后，菌体内乳酸环丙沙星蓄积量增加最显著者，确立为本试验所需的具有单一外排机制的大肠埃希菌模型。结果：在20株多重耐药火肠埃希菌中，∥胡和印，．C基冈朱发生突变的有两株

4、，而其中73．2存在外排泵基冈高水平表达，故将此株细菌作为后续试验的细菌模璎。2．中药细菌外排泵抑制剂的筛选采用水提与醇提法，针对每一味中药制备两种中药储备液，通过采用美国临床实验室标准委员会(NCCLS)推荐的肉汤稀释法，测定乳酸环丙沙星及200种中药提取物对耐药菌及质控菌A1’CC25922的最小抑菌浓度(MlC)，并将中药提取物与乳酸环丙沙星联合，检测其对乳酸环丙沙星的协同作用。结果：得到中药储备液200种，其中对耐药大肠埃希菌有抑菌作J}；J的有142种，抑菌率为71％；存在联合抑菌效果的有4种，分别是A，B，C，D。耐药抑

5、制作用表现为使大肠埃希西南大学硕十毕业论文菌耐药模型M1C+卜降4埘倍；124种中药提取物与乳酸环丙沙星联用表现为拮抗作用。结论：部分中药提取物联合乳酸环丙沙星可以降低大肠埃希菌对乳酸环丙沙星的耐药性，表现出良好的耐药抑制作用，但大多数中药提取物与乳酸环形沙星联用表现为拮抗作用，临床需慎用。3．有效中药提取物对受试菌株乳酸环丙沙星蓄积量的影响应用高效液相色谱法检测质控菌和耐药菌在分别加入亚抑菌浓度四种中药提取物前后，细菌体内乳酸环丙沙星(Cip)的蓄积量。结果：加入四种中药提取物后，质控菌和耐药菌体内乳酸环丙沙星蓄积量均有所增加，其

6、中加入A提液后，Cip蓄积量变化最为显著，为3．7倍。结论：亚抑菌中药提取物可以增加大肠埃希菌耐药菌与质控菌体内乳酸环丙沙星的蓄积量，表现出良好的外排抑制作用。4．中药提取物对耐药大肠埃希菌外排泵基因口c朗基因表达量的影响通过砸抑菌浓度中药提取物处理药菌大肠埃希菌．利用荧光定量PCR技术(RealⅢImF1uorescentQu柚titativcPCR)检测其外排泵基因口c硝表达量的变化。结果：处理后耐药大肠埃希菌其口c耐表达量均降低，经亚抑菌浓度八B，C，D提液处理过的大肠埃希菌外排泵基因表达量分别为原来的O．16，0．24，O．

7、19和0．33倍。结论：表明亚抑菌浓度中药提取物对犬肠埃希耐药菌的外排泵基因表达量有明显的抑制作用。关键词：大肠埃希菌喹诺酮类药物中药耐药性外排泵基因口c纠ⅡABSTRA(=，rScreenbioactiveconstituentsefnuxpumpSCreenD10aCtlVeC0nStltUentSeIIlUXpUmp●●1●J●』1●』●1／弋1●1●●nlnnlbltorSlntracIltlonalLnlneSemecIlClne0IMultipledrug-resistant互Xc办P—c屁施cD龙Quinolonesa

8、ndStudyonMechanismDiscipline：BasalVbterinaryScienceMastercandidate：ZhangJingSupeIVisor：Prof．WuJun-weiABSTRACTInrecent