斑蝥素提取、特异性抗体制备及其酶联免疫检测方法的研究

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1、ExtractionofCantharidin,PreparationofSpecificAntibodyandStudyofELISAMethodAThesisSubmittedtoChongqingUniversityinPartialFulfillmentoftheRequirementfortheDegreeofMasterofSciencebyChenJieSupervisor:YinYoupingMajor:MicrobiologyCollegeofBioengineeringofChongqingU

2、niversity,Chongqing,China.May2008重庆大学硕士学位论文中文摘要摘要斑蝥素（cantharidin），是中药材斑蝥的有效成分，属于倍半萜烯类天然防御性毒素，由于其独特的抗癌性，人们在其抗癌机制以及毒理药理上进行了大量的研究，并合成了大量的斑蝥素衍生物。但是，仍然在斑蝥素的生物合成位点、合成途径已经斑蝥素的抗癌机制上存在许多疑难问题。目前，斑蝥素的检测方法有重量法、酸碱法、紫外分光光度法、高效液相色谱法、气相色谱法等，但这些方法通常需要昂贵的色谱仪器，有的还必须事先对样品进行繁杂的纯化

3、处理，而且对操作人员的技术要求很高。然而，随着免疫学的发展，酶联免疫检测方法不再仅仅局限于大分子的检测，而是日益广泛的被用于小分子物质的检测。虽然小分子物资在结构上不具有抗原性，但是通过与大分子物质偶联后便具有了抗原的免疫原性和免疫反应性。进而，就可以构建小分子的酶免疫检测方法了。研究目的：从斑蝥体内提取斑蝥素，以此合成斑蝥素羧基衍生物N-羧乙基斑蝥酰亚胺，探究合成反应最佳条件及产率并比较二者的毒性；通过斑蝥素和β-丙氨酸合成半抗原N-羧乙基斑蝥酰亚胺，并借助半抗原的偶联来制备人工完全抗原，免疫兔子获得特异性抗体

4、，最终根据抗原抗体反应原理建立斑蝥素间接竞争ELISA检测方法及其检测曲线。研究方法：以混合提取法、震荡提取法及快速提取法等方法分别提取斑蝥素，并进行比较；在单因素不同的体系中斑蝥素与β-丙氨酸进行缩合反应，且用GC、TLC、UV、MS、NMR等对提取物及反应产物进行鉴定，并通过改良寇氏法测定斑蝥素及其衍生物的LD50以比较其胃毒毒性；以NHS酯法用偶联剂DCC、NHS将半抗原N-羧乙基斑蝥酰亚胺偶联到载体蛋白上，用摩尔吸光系数法进行检测确认偶联成功后，用斑蝥素人工完全抗原免疫兔子；ELISA方法检测抗体效价达到

5、1：3200后分离血清，并用CNBr活化的琼脂糖凝胶4B亲和层析对抗血清中的进行纯化，对于纯化的结果借用SDS-PAGE以及ELISA方法进行检测；将纯化的斑蝥素特异性抗体及斑蝥素人工完全抗原采用间接竞争法构建斑蝥素间接竞争ELISA检测方法，并建立检测曲线，探讨该检测曲线的检测范围及其极限，用GC法来验证蝥素间接竞争ELISA检测方法在检测斑蝥粗提物斑蝥素的含量中的准确性与可靠性。研究结果：混合提取法得到的斑蝥素纯度达98.53%，经结构鉴定可以确认缩合产物为N-羧乙基斑蝥酰亚胺；缩合反应的最佳反应条件：n（斑

6、蝥素）/n（β-丙氨酸）=1/1.2；媒介溶剂与催化剂均为Et3N，最佳用量为1mol的斑蝥素需72mlI重庆大学硕士学位论文中文摘要的Et3N，125～150℃下脱水反应4～5h，产率可达74.40%。衍生物对小鼠的胃毒性仅为斑蝥素毒性的1/400；经过鉴定，采取NHS酯法得到的人工完全抗原中半抗原N-羧乙基斑蝥酰亚胺与载体蛋白BSA、OVA的结合比分别为25:1、23:1；兔抗血清的效价在纯化之前为1:3200，纯化后达到1:6400～1:12800，为纯化前的2～4倍；斑蝥素间接接竞争ELISA检测方法及其

7、测定曲线为y=-0.0697x+0.1894，该曲线的检测范围是2.4mg/ml～2.4mg/L，并且，在对斑蝥的粗提物进行斑蝥素含量的实际检测中，斑蝥素酶免疫测定方法与气相色谱法在统计学上无明显差异。关键词：斑蝥素，N-羧乙基斑蝥酰亚胺，特异性抗体，亲和层析，ELISAII重庆大学硕士学位论文英文摘要ABSTRACTCantharidinistheactiveingredientofthecanthariswhichisTranditionalChineseMedicines.Cantharidinisalso

8、onekindofnaturaldefensivetoxinsofTerpenoid.Therearealotofresearchesachievedabouttheanti-cancermechanisms,itspharmacologyorthetoxicology.Andalargenumberofcantharidinderivativesweresynthesi