cbp分子在cd59 gpi介导的t细胞抑制信号转导中的作用研究

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1、中文摘要目的研究GPI锚固蛋白CD59与Cbp在细胞上的定位及在T细胞信号转导通路中的相互作用，以探讨CD59向T细胞内传递信号的相关机制。方法应用细胞免疫荧光技术，通过激光共聚焦荧光显微镜系统对CD59、Cbp的定位进行了分析。利用RNA干扰技术，设计针对Cbp基因的寡核苷酸序列，克隆至线性化的pSUPER载体中构建pSUPER—siCbp重组质粒并进行鉴定。采用电转染方法转染Jurkat细胞，荧光显微镜观察GFP基因表达，并行RT—PCR矛[1westernblot检测转染细胞中Cbp的表达。将pSUPER—siCb

2、p、pEGFP—N3一Cbp、突变型pEGFP—N3一Cbp三种质粒进行扩增并酶切鉴定，同样转染Jurkat细胞，检测各转染组Cbp蛋白的表达。CD59mAb交联刺激细胞后，westernblot检测各组Csk、p-ZAP一70并tlp—Fyn表达量；MTT检测细胞增殖；ELISA检测细胞上清中自介素2(IL一2)的水平。结果激光共聚焦结果显示：细胞静止时，Cbp分子点状聚集于膜上，CD59分子广泛分布；随着细胞活化，Cbp少量的散在分布，而CD59表达增多并点状聚集。pSUPER—siCbp重组质粒经菌液PCR、DNA

3、PCR、限制性内切酶双酶切分析和DNA测序鉴定正确。各转染组可表达绿色荧光蛋白，转染J2一pSUPER—siCbp重组质粒的Jurkat细胞中Cbp基因表达量明显低下其他各组。选取J2ff[质粒进行后续检测结果：与未转染组比较，在基因与蛋白水平，干扰组Cbp表达减少，而高表达组和突变组Cbp表达增加。CD59mAb交联刺激细胞后，与朱转染组比较，干扰组和突变组细胞增殖快，IL一2分泌增多，Csk、p-ZAP一70,币llp—Fyn增多，突变组变化更明显；高表达组细胞则与之相反。结论CD59可借助棕榈酰基团使Cbp分子磷酸

4、化，向细胞内传递抑制信号，引起细胞内相关分子的一系列变化，为探讨CD59与cbp在T细胞信号转导通路中相互作用及CD59GPI胞内信号转导机制奠定基础。硕士研究生姬静(免疫学)指导教师高美华教授关键词：CD59；Cbp；shRNA；信号转导；免疫荧光；Src家族酪氨酸激酶AbstractobjecfiveTostudytheinteractionsbetweenCD59andCbpinJurkatcellsignaltransductionandexplorethemechanismsofCD59totheTcellsi

5、gnaltransduction．MethodsThe10cationofCD59andCbpwasanalyzedusingtheconfocallaserscanningmicroscopewiththeimmunofluorescencetechnique．TwOpairsofshRNAweredesigned．synthesizedandclonedintothelinearizedpSUPERvector．ThentherecombinantvectorsCbp．pSUPERwereidentified．The

6、Jurkatcellwastransfectedwiththerecombinantplasmidsusingelectrictransfectionmethods，theexpressionofGFPgenewasdetectedbyfluorescencemicroscopyandtheexpressionofCbpgenewasconfirmedbyRT．PCRandwesternblot．ThepSUPER．siCbp．pEGFP．N3．Cbpandmutationalwereidentifiedbydigest

7、ion，transfectedintoJurkatcellsanddetectedtheexpressionofCbp．Afterantibodycross—linkingofCD59receptors．theexpressionofCsk．P．ZAP．70andp-Fynwasdetectedindifferentgroups．ThecellproliferationactivitywasmeasuredbyM1vrcolorimetry，whileinterleukin2(IL．2)incellsupernatant

8、sfluidwasdetectedbvELISA．ResultsTheresultsofimmunofluorescenceassaysshowedthatCbpwaspunctateaggregationandCD59wasscattereddistributioninrestingcellmembrane．Acc