t细胞cd59gpi对lat脂筏内移位及跨膜信号转导的作用机制研究

《t细胞cd59gpi对lat脂筏内移位及跨膜信号转导的作用机制研究》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在学术论文-天天文库。

1、摘要目的构建T细胞活化连接蛋白(LAT)-EGFP融合蛋白真核表达载体，以及利用基因点突变技术使LAT-EGFP的棕榈酰化位点突变构建LAT-EGFP．M真核表达载体，并将两种真核表达载体转染入Jurkat细胞中稳定表达，研究CD59在T细胞信号转导过程中与LAT的相互作用，探讨CD59向胞内传递信号的机制。方法从人T细胞白血病细胞Jurkat细胞中提取总RNA，利用RT-PCR的方法扩增LAT基因，构建LAT-EGFP真核表达载体，并利用点突变技术使LAT-EGFP近膜处的棕榈酰化位点的络氨酸替换为甘氨酸，构建棕榈酰化位点突

2、变的LAT-EGFP．M真核表达载体；采用电转染的方法转染Jurkat细胞，双抗交联CD59后，荧光共聚焦显微镜下观察LAT分布情况的变化；用噻唑蓝(MTT)比色法检测抗体交联前各组后Jurkat细胞增殖情况差别；应用ELISA检测各组细胞上清中IL．2的变化水平：用Westernblot技术检测抗体交联后LAT-EGFP和LAT-EGFP—M的磷酸化程度。结果经限制性内切酶酶切、westernblot技术及测序鉴定LAT-EGFP真核表达载体和LAT-EGFP．M构建成功；抗体交联CD59之后，LAT-EGFP．M较LAT-

3、EGFP相比不能定位聚集y-CD59所在的脂筏区域，并且转染了突变LAT-EGFP．M质粒的Jurkat细胞增殖速度和IL一2分泌能力低丁转染LAT-EGFP质粒的对照组。转染空载体EGFP-N3及术转染的细胞，LAT-EGFP—M的磷酸化样度远低于LAT-EGFP。结论L虹参与CD59信号转导过程，并且二者作l_I{位点与棕榈酰化基团有关。这为研究CD59类GPI锚i古蛋白的信号转导方式奠定了基础。关键词：CD59：T细胞活化连接蛋白；棕榈酰化；T淋巴细胞AbstraetObjectiveConstructedaeukary

4、oticexpressionplasmidforenhancedgreenfluorescentprotein(EGFP)andLATfusionprotein。(LAT-EGFP)andLAT-EGFP—M(twocysteinesofwhichnearthejuxtamembraneregionweresubstitutedforalanine)，andtransfectedthetwovectorsintoJurkatcellsbyelectroporation．ObservedthealternationofTcell

5、signaltransductionafterthecrosslinkagewithanti．CD59mAb．MethodsTheprimersweredesignedaccordingtothecDNAencodingsequenceofLATcoresequenceexcerpttheterminationcodon．thesegmentsofPCRwereclonedintoPEGFP-N3vector,andandrecombinevectorwereidentifiedbyrestrictedenzymesanaly

6、sis，westernblotting；andDNAsequencing．ConstructedaeukaryoticexpressionplasmidLAT-EGFP-M(twocysteinesofwhichnearthejuxtamembraneregionweresubstitutedforalanine)，andtransfectedLAToEGFP,LAT-EGFP．M，PEGFP-N3intoJurkatcellsrespectively．AfterthecrosslinkageofCD59,monitoredt

7、helocationofthefusionproteinLAT-EGFPandLAT-EGFP—Mwithconfocalmicroscopy．ThecellproliferationactivitywasdeterminedbyMTTcolorimetry，whileintedeukin2‘(IL一2)incellsupematantsfluidwasdetectedbyELISA．WesternblottingwasusedtotestthephosphorylationlevelsofLAT．Resultsrestric

8、tedenzymesanalysisandDNAsequencingshowedthatthesequencesofLAT-EGFPtransgenicplasmidwascorrect．Afterthecrosslinkageofanti-CD59mAb，LAT-EGFP-