CD28和TCR跨膜信号转导的机制研究

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1、作者姓名：指导教师：学位类别：学科专业：培养单位：密级：博士学位论文CD28和TCR跨膜信号转导的机制研究2013年5月学一大㈣院咖学姒科㈣国螂中㈨固IIIIIIIIIIIIIIIIIIIIY2431037Mechanisticstudyofthecross—membranesignaltransductionofCD28andT-·cellreceptorWeiYangAThesisSubmittedtoTheUniversityofChineseAcademyofSciencesInpartialfulfillmentofthere

2、quirementForthedegreeofDoctorofNatureScienceInstituteofBiochemistryandCellBiologyShanghaiInstitutesforBiologicalSciencesChineseAcademyofSciencesMay,2013谨以此博士学位论文献给我的父母，感谢他们对我的辛勤养育。CD28和TCR的跨膜信号转导的机制研究目录摘要⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯1中文摘要⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯1英文

3、摘要⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯31．弓I言⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯，62．材料与方法⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．212．1实验材料⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．212．1．1常用缓冲液配方⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯212．1．2基本化学试剂⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯222．1．3试剂盒，酶类及抑制剂⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯252．1,4细胞系⋯⋯⋯⋯⋯⋯

4、⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯262．1．5抗体⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．262．1．6仪器⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．282．2实验方法⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯302．2．1脂质双分子层LUV(LargeUnilamellarVesicle)的制备⋯⋯⋯⋯⋯302．2．2脂质双分子层Bicelle的制备⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．312．2．3CD3／CD28胞内段蛋白表达与纯化⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯

5、⋯⋯⋯⋯312．2．4CD3／CD28胞内段肽段的荧光标记⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．342．2．5平衡．微透析方法检测蛋白与酸性磷脂的结合⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯一342．2．6圆二色谱检测蛋白结合酸性磷脂脂质双分子层后的构象变化⋯⋯⋯352．2．7酪氨酸荧光光谱检测酪氨酸在脂质双分子层中的包埋⋯⋯⋯⋯⋯⋯362．2．8荧光芡振能量转移(FRET)检测CD28与细胞质膜内层的结合⋯．．372．2．9体外磷酸化实验(InVitroPhosphorylation，IVP)⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯382．2．10抗体交联激活JurkatT细胞，检测Ca

6、2+内流⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．392．2．11小鼠脾脏CD4+T细胞的分离⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯392．2．12抗体交联刺激小鼠原代CD4+T细胞，胞内染色及流式检测1L．2的表中国科学院生物化学与细胞生物学研究所博士毕业论文CD28和TCR的跨膜信号转导的机制研究达⋯⋯．⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯402．2．13JurkatT细胞免疫荧光染色⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯412．2．14Spinning．DiskConfocal或TIRFM捡测T细胞Ca!+内流以及Ca

7、!+microdomain．⋯．⋯．．．．．⋯⋯⋯⋯⋯．．⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．．⋯．．．．⋯．．⋯．．⋯⋯⋯．．．．．．zI：12．2．15JurkatT细胞激活，检测TCR磷酸化⋯．⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．433．实验结果⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．473．1第一部分：细胞质膜及其电荷环境调控共刺激受体CD28的活化⋯⋯⋯473．1．1CD28胞内段与酸性磷脂脂质双分子层结合⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．473．1．2活细胞FRET检测CD28胞内段与细胞质膜结合⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯503．1．3CD28胞内

8、段与酸性磷脂脂质双分子层结合引起其构象变化⋯⋯⋯一523．1．4CD28胞内段与酸性磷脂保护其酪氨酸残基不被磷酸化⋯⋯⋯⋯⋯一563．1．5ca2+促进CD28胞内段从酸性磷脂双分子层上解离⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯。