gpi锚固蛋白cd59通过lat介导t细胞信号转导的作用机制研究

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1、分类号：R392.11密级：UDC：610学校代码：11065硕士学位论文GPI锚固蛋白CD59通过LAT介导T细胞信号转导的作用机制研究王丽娜指导教师高美华教授学科专业名称免疫学论文答辩日期2015年5月30日摘要目的：探讨在T系急性白血病的Jurkat细胞中，GPI锚固蛋白CD59通过接头分子LAT介导细胞的增殖、活化、凋亡等生物学效应，研究GPI类锚固分子CD59介导T细胞信号转导的作用机制。方法：分别构建LAT-EGFP（LAT组，LAT分子高表达）、LAT-M-EGFP（LAT-M组，LAT分子的棕榈酰

2、化位点突变）、neg-EGFP（neg组，阴性对照组）融合蛋白，以慢病毒为载体，转染入Jurkat细胞中，建立稳定表达的细胞株。CD59单克隆抗体交联刺激CD59分子前后，利用激光共聚焦显微镜观察CD59和LAT分子在细胞膜上的定位和分布情况；利用CCK8和流式细胞术检测各组细胞的增殖活性和凋亡情况；通过电镜观察各组细胞中细胞器的变化情况；利用qRT-PCR和Westernblot在mRNA和蛋白水平检测T细胞信号转导通路中相关信号分子的表达情况。结果：共聚焦显微镜下观察到各组细胞的转染效率均在80%以上，转染细

3、胞株构建成功。LAT组中，CD59和LAT分子均表达于细胞膜上且部分LAT分子有点簇状聚集区-脂筏所在部位；CD59单克隆抗体交联刺激后，CD59和LAT的点簇状聚集区更为明显且共同定位于脂筏。LAT-M组中，LAT分子在细胞膜上散在分布，未出现点簇状聚集区；CD59抗体作用后无明显变化。与阴性对照组相比，LAT组的细胞增殖活性最高且出现明显的中晚期凋亡现象，LAT-M组细胞的增殖活性最低，中晚期凋亡率最高；CD59抗体作用后，LAT组和neg组细胞增殖活性均明显增高，neg组细胞凋亡减少，LAT组无明显变化，L

4、AT-M组细胞凋亡增加。在基因水平上，LAT组的表达高于neg组和LAT-M组，CD59抗体交联刺激后，LAT组无明显变化，neg组和LAT-M组均较刺激前有所增加。Westernblot结果显示，CD59抗体交联后，LAT组和neg组的非磷酸化蛋白表达水平均明显降低，LAT-M组无明显变化。结论：GPI锚固蛋白CD59通过跨膜接头蛋白LAT对T细胞信号转导发挥调控作用，且LAT的棕榈酰化是其发挥功能所必需的。这为其它GPI类锚固分子信号转导的机制研究提供了新视野和新方向。硕士研究生王丽娜（免疫学）指导教师高美华

5、教授关键词：CD59；Jurkat细胞；LAT；信号转导AbstractObjectiveObservethebiologicaleffectsofGPI-anchoredproteinCD59inproliferation,activationandapoptosisonJurkatcellsthroughLATandfurthertostudythemolecularmechanismofCD59inTcellsignaltransduction.MethodsLAT-EGFP,LAT-M-EGFP,neg-

6、EGFPfusionproteinswereconstructedandcarriedbylentivirusvectors,thentransfectedintoJurkatcellstoestablishstablyexpressingcelllines(namedLATgroup,LAT-Mgroupandneggroup,respectively).LaserscanningconfocalmicroscopewasusedtoobservethelocationanddistributionofCD59

7、andLAT;CCK8andFlowcytometrywereusedtodetectthecellviabilityandapoptosisrate;Electronmicroscopewasusedtoobservethechangeofcellularorganelleindifferentgroup;qRT-PCRandwesternblotwereusedtoexaminetheexpressionofsignalmoleculesonmRNAandproteinlevels.ResultsThetra

8、nsfectionefficienciesindifferentgroupwereallnearly80%.TheimmunofluorescenceresultsshowedthatinLATgroup,CD59andLATmoleculesdistributedonthemembraneandpartofthemhadclusters(thesitewherelipi