荷瘤小鼠t细胞表面cd59分子的表达与t细胞信号转导的相关性研究

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1、荷瘤小鼠T细胞表面CD59分子的表达与T细胞信号转导的相关性研究【关键词】荷瘤小鼠T细胞　CD59分子　T细胞信号　　CD59是一种以糖基磷脂酰肌醇(glycosylphosphatidyinositol,GPI)锚着于细胞膜表面的糖蛋白,广泛分布于造血细胞、非造血细胞及多种组织细胞表面,其主要功能是调节补体活化,通过与补体攻膜复合物（membraneattackplex,MAC）装配过程中的C8和/或C9结合从而抑制补体的活化［1］。有许多研究证实,CD59也参与T细胞的黏附及细胞信号的转导［2］。荷瘤机体的T细胞往往出现活化信号转导异常,导致其功能低下,甚至处于无反应状态［3］。

2、最近有学者研究发现CD59在肿瘤患者的红细胞上的表达明显降低,导致天然免疫的失衡［4］。但对于荷瘤机体内T细胞CD59的表达情况及对T细胞活化的影响,尚未见报道。本研究将通过建立小鼠HeLa细胞肿瘤模型,对荷瘤机体T细胞的CD59表达情况及对T细胞活化的影响进行探讨。　　1材料和方法　　1.1材料HeLa细胞致瘤模型小鼠由本课题组前期建立;淋巴细胞分离液购自天津市灏洋生物制品科技有限公司;纯化的CD59单克隆抗体（mAb）为BDBiosciences的产品;荧光探针Fluo3/AM购自Biotium,HEPES(Solarbio);FITC标记山羊抗小鼠IgG(HL)为中杉金桥公

3、司产品,FITC标记的抗小鼠CD25和PE标记的抗小鼠CD4均购自Biolegend公司。　　1.2方法　　1.2.1细胞制备取前期HeLa细胞致瘤的小鼠和正常对照小鼠,无菌分离两组小鼠胸腺,制备单细胞悬液,淋巴细胞分层液获取单个核细胞,再经尼龙柱处理获取T淋巴细胞,苔盼蓝染色细胞活率95%以上。调整细胞密度为4×108/L,加入100mL/L胎牛血清,青霉素、链霉素各100mL/L的RPMI1640培养液10mL,50mL/LCO2、37℃培养箱培养。　　1.2.2T细胞表面CD59表达取1mL两组T细胞,PBS洗3遍,滴于载玻片上吹干,950mL/L乙醇固定5min,吹干;加CD

4、59mAb(1∶640),10μL,对照加IgG2a,10μL,37℃湿盒孵育45min,PBS洗3遍,5min/次,吹干;加FITC标记的山羊抗小鼠IgG(HL)（1∶320）,10μL,37℃湿盒孵育45min,PBS洗3遍,5min/次,吹干;荧光显微镜观察。荧光的检测及结果判定:随机选取5个视野,根据特异荧光强弱依次用弱阳性（±）、阳性（+）、强阳性（）表示,无特异性荧光的用阴性（-）表示,并根据荧光强度记分:阴性为0分,弱阳性为1分,阳性为2分,强阳性为3分。　　1.2.3细胞内Ca2+的测定(1)Fluo3/AM负载细胞:取前期准备的小鼠淋巴细胞,经苔盼蓝染色细胞活

5、率95％以上,调整细胞密度为5×109/L,HEPES缓冲液（pH7.4）洗3遍,加10μmol/LFluo3/AM,100μL,37℃孵育40min。孵育后,1000r/min,离心10min,吸弃Fluo3/AM上清,HEPES缓冲液（pH7.4）洗3遍。加0.5mLHEPES缓冲液,待检。(2)T细胞内Ca2+的测定:使用Nikon激光共聚焦显微镜检测细胞内的Ca2+,按文献方法［5］检测。结果以未加处理因素前的荧光值为100%。　　1.2.4流式细胞术检测T淋巴细胞CD25表达T细胞中加入1mg/LCD59mAb,37℃孵育48h。调整细胞密度2×108/L,吸取250μ

6、L不同组细胞悬液平均分放1、2、3号EP管中,设置对照组和同型对照组,加入FITC标记的抗小鼠CD25,PE标记的抗小鼠CD4,各10μL,混匀后,4℃避光作用30min,50g/L白蛋白PBS洗2次,5min/次。多聚甲醛固定,避光保存,24h内流式细胞仪进行分析。　　1.2.5统计学分析所有数据以x±s,两样本比较采用双样本t检验,全部统计处理均在SPSS10.0软件上进行。　　2结果　　2.1T细胞CD59表达分别观察对照组和实验组T细胞表面CD59特异荧光的表达,实验组荧光表达明显减弱,差别有统计学意义（P<0.05,表1）。　　表1两组T细胞CD59表达的比较（略）　

7、　2.2CD59mAb对两组T细胞［Ca2+］i的影响加入CD59mAb后,静息T细胞中［Ca2+］i明显升高,1min正常对照组即升至(452.7±65)%,而荷瘤组升至（287.1±56）%,两者比较差异有统计学意义（P<0.01,表2）。　　2.3CD59mAb作用下小鼠T细胞CD25的表达小鼠T淋巴细胞静息状态下很少表达CD25分子,经CD59mAb刺激48h后,CD25表达增加。荷瘤组CD25表达比正常组明显减少,差异有统计学意义（P<