cd59分子在人t细胞抗原特异性活化中的作用研究

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1、青岛大学博士学位论文CD59分子在人T细胞抗原特异性活化中的作用研究姓名：解西河申请学位级别：博士专业：病原生物学指导教师：高美华20120529中文摘要CD59分子在人T细胞抗原特异性活化中的作用研究目的运用RNA干扰技术使正常人CD4+或CD8+T细胞的CD59基因表达发生沉默，然后观察其对负载肿瘤抗原的DCs或抗CD3／CD28／CD59(或IgG2a)包被珠的刺激反应，探讨CD59分子在T细胞抗原特异性活化中的作用及相关机制。方法用含IL一4和GM-CSF的DC无血清培养基诱导培养健康供者的贴壁PBMCs，负载肿瘤抗原后，加入TNF—a促进DCs成熟。将CD

2、59一siRNA表达质粒siCD59和空质粒pSRNG分别转染PA317细胞，包装出逆转录病毒，用于感染悬浮的PBMCs。G418筛选病毒感染细胞后，利用免疫磁珠纯化分选出CD4+T细胞和CD8+T细胞。利用FACS检测、补体溶解试验和PMA刺激CD4+T细胞活化试验评估CD59一siRNA对CD59、CD3、CD28表达以及T细胞非抗原特异性活化能力的影响。为探讨CD59分子在T细胞发生抗原特异性活化中的作用，利用负载肿瘤抗原的DCs刺激siCD59一T细胞(表达CD59一siRNA的T细胞)和cCD59-T细胞(对照细胞，空质粒来源的逆转录病毒感染的T细胞)，分

3、别检测IL-2+CD4+T细胞、IFN—Y+CD8+T细胞和CD4+CD25+FoxP3+调节性T细胞(Tregs)的频数以及CD4+或CD8+T细胞增殖强度。为了解CD59分子发挥抑制T细胞抗原特异性活化的机制，利用抗CD3／CD28／CD59(或其同型对照抗体IgG2a)包被微珠刺激CD4+或CD8+T细胞，在混合培养介质中加入(或不加)抗CD59单抗的情况下，检测细胞的增殖强度。结果诱导培养的负载肿瘤抗原的DCs高表达CD40、CD83、CD86和HLA—DR等细胞成熟标志。在分选出的CD4+或CD8+T细胞中，GFV细胞的比例>95％。siCD59一T细胞C

4、D59分子表达水平显著降低，对补体溶解的敏感性明显增强；对PMA刺激具有正常的活化反应能力，但对CD59分子交联的反应降低；CD3和CD28的表达没有明显变化。利用负载肿瘤抗原的DCs进行刺激时，CD4+或CD8+siCD59一T细胞的活化、增殖反应显著增强；CD4+siCD59一T细胞与CD4+cCD59一T细胞之间，CD4+CD25+FoxP3+Tregs增殖幅度无明显差别。用抗CD3／CD28／CD59包被珠进行刺激时，siCD59一Z细胞表现出更强的增殖活性；在珠／T细胞培养介质中加入抗CD59单克隆抗体后，siCD59一T细胞和cCD59-T细胞的增殖反应

5、均显著增强，同时，前者的增殖活性仍明显强于后者。用抗CD3／CD28／IgG2a包被珠进行刺激时，siCD59一T细胞和cCD59一T细胞的增殖反应没有明显差别：在珠／T细胞培养介质中加入抗CD59单克隆抗体后，二者的增殖反应无明显变化。结论在TCR识别、结合抗原肽一MHC复合物时，CD59分子通过与抗原提呈细胞上的相应配体结合而抑制人CD4+或CD8+T细胞发生抗原特异性活化。CD59分子对人T青岛大学博士学位论文肿rJilflrflflJJfl[IlflllfllIY2088504细胞抗原特异性活化的抑制效应与CD4+CD25+FoxP3+Tregs的作用无关。

6、博士研究生解西河(病原生物学)指导教师高美华教授关键词：CD59抗原；小RNA干扰；树突状细胞；淋巴细胞活化；调节性T细胞英文摘要RoleofCD59MoleculesinAntigen—specificActivationofHumanTCellsABSTRACTObjectiveResponsesofCD4*orCD8+humanTcellswhichCD59geneexpressionhadbeensilencedbysiRNAStobothDCsloadedwithtumorantigensandbeadscoatedwithanti·CD3／CD28／CD

7、59(orIgG2a))wereinvestigatedinordertoexploretheroleofCD59moleculesinantigen．specificactivationofhumanTcells．MethodsIL-4andGM-CSFwereusedtogenerateDCsfromadherentPBMCsofhealthydonors．DCswasidentifiedbyFACSaftertheywerepulsedwithtumorantigensandmaturatedwith1飞限一a．Non-adherentPBMCsweree